學術期刊發文報道韓春雨NgAgo基因編輯不可重複

　　2016年5月2日，來自河北科技大學副教授韓春雨實驗室的論文《利用NgAgo進行DNA引導的基因組編輯》發表於《自然-生物技術》，就此在中國學術界和公眾領域掀起了一場軒然大波。數月以來，國內外數十位科學家在自媒體和公共媒體上對這項技術的態度從最初的歡迎轉變為質疑；過去一周，《細胞研究》和《蛋白與細胞》兩個遵循同行評議的專業學術期刊先後發表論文，報道了中外數十個研究組無法重複NgAgo的基因組編輯結果。據悉，《自然-生物技術》也將在近期刊發相關通訊文章。

　　我們很高興地看到，學術界具有強大的自身凈化能力。特別是在新媒體時代，富有專業精神和嚴肅態度的科學家們可以及時將最新科技進展在公共層面進行展示、質疑、和討論。然而，我們也深深地感到遺憾，在同行實名質疑四起之時，河北科技大學作為該論文的通訊單位卻沒有按照我國基金委、科技部、教育部屢次三番強調的學術準則開展任何調查。一個國家、一個單位的學術聲譽不僅僅是由學術成果構建，還體現在應對學術質疑的態度是否符合國際學術道德規範。我們再次敦促河北科技大學等國內有關科研管理機構針對韓春雨博士的NgAgo論文展開專業化調查。我們預見：針對已經成為社會公眾事件的NgAgo論文的調查方式和調查結果將對中國的學術道德建設和科研文化產生重大和深遠的影響。編譯   林小鹿

　　Protein & Cell 編輯部評論NgAgo: 希望還是失望？

　　2016年11月16日，《蛋白質與細胞》（Protein& Cell）期刊在線發表了一篇由國內外21個課題組聯合發表的題為《有關NgAgo的疑問》（Questions about NgAgo）的學術論文，報道多個實驗室均無法重複韓春雨的NgAgo基因編輯新技術。同期還配發了編輯部的評論《NgAgo：希望還是失望？》（NgAgo: A Hope or A Hype?）。

　　評論首先回顧了基因編輯技術的發展歷史。長久以來，生物醫學研究領域的科學家們一直在堅持不懈地尋找一種方法，在特定細胞或者生物體內精確修改遺傳信息。這種方法一般稱為「基因編輯」或者「基因組編輯」，無論是在科學研究方面還是在醫療應用方面，基因編輯技術都展示出了誘人的價值和潛力。上世紀60年代，限制性酶的發現導致了重組DNA技術的誕生，開創了現代生物技術。而近些年來，TALEN和CRISPR技術的發展，更是開創了基因組編輯時代，成為了當今最有希望應用於臨床醫學治療的基因編輯技術之一。

　　儘管我們目睹了這些令人振奮的成就，但是基因組編輯技術的進一步發展仍然存在著巨大的挑戰，特別是在提高編輯效率和消除脫靶效應方面。 2016年5月，高峰等研究者在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）上發表論文報道，古細菌來源的一種DNA核酸酶（NgAgo）能以DNA寡核苷酸引導的方式精確地識別和有效地編輯哺乳動物細胞的基因組DNA。鑒於研究人員對新的基因組編輯工具的渴望，這篇論文立刻引起了強烈的關注，並在科學界產生了廣泛的影響。例如，有人認為，NgAgo可以作為一個重要的甚至更優的方法替代CRISPR系統，因為後者的基因編輯功能需要短序列的RNA。

　　然而，最初幾個月的興奮之後，關於NgAgo基因組編輯技術可重複性的爭議日益積累，很多在線科學論壇都出現了質疑的聲音，報道NgAgo的基因組編輯能力不像其原始論文報告的那樣有效。此外，國內外研究人員已經開始公開或私下地討論他們不能重複出高峰等人的關鍵結果。由於NgAgo基因組編輯技術的持續爭議，《蛋白質和細胞》決定在本期發表一篇學術短文，由來自多個機構的20個獨立研究組聯合撰寫並提供了有關數據，反駁了韓春雨文章的最初報告。在這篇通信中，作者們表明，NgAgo在一系列實驗條件下對哺乳動物細胞的基因組DNA沒有編輯活性。《蛋白質與細胞》指出，儘管圍繞著NgAgo技術的爭議已經發酵了幾個月，但大多數批評沒有以正式和學術的方式提出，特別是沒有發表在同行評議的科學雜誌上，這大大限制了科學共同體對雙方論點的客觀評估。因此，《蛋白質與細胞》相信並希望這些相互矛盾的結果的發表，可以提醒科學共同體重新審視NgAgo，並有助於基因組編輯技術的發展。

　　簡介：Protein & Cell 通信論文有關NgAgo的疑問

　　來自18個研究機構的20名科學家對NgAgo提出了質疑。2016年5月，《自然-生物技術》發表了韓春雨組的論文，報道使用NgAgo蛋白可以在哺乳動物細胞基因組上47個位點100%進行基因編輯，效率為21.3%—41.3%。《有關NgAgo的疑問》的作者們在多種細胞系、小鼠和斑馬魚等模式生物上實驗NgAgo的基因編輯功能，在大多數情況下，使用了密碼子優化的NgAgo和類似CRISPR/Cas9的實驗方法，然而在全部實驗中，NgAgo都不能進行基因編輯。接著，部分作者轉而使用該文通訊作者韓春雨使用過的NgAgo表達載體進行實驗，該載體或者直接來自於韓春雨研究組，或者來自於韓春雨提供給Addgene的載體。出乎意料的是，更改載體仍然不能進行基因編輯，因此作者們直接對韓春雨組論文圖4的實驗進行重複。來自8個不同實驗室的代表性結果（本文圖1）顯示，嚴格按照高峰等論文的實驗流程以及韓春雨在Addgene網站更改的流程，用T7E1體系直接重複高峰等論文圖4的相同位點，都看不到基因組編輯的結果。此外，本文的補充數據展示了大量來自不同實驗室的嘗試，分別在和高峰等論文相同或者不同的細胞系、模式生物中使用了NgAgo進行基因編輯，結果均為陰性。

　　韓春雨對公眾說，NgAgo實驗需要「高超的實驗技巧」，而且做NgAgo實驗需要先重複出來圖3c。圖3c是向細胞系轉染NgAgo和靶向GFP的gDNA。作者們證實確實能看到GFP表達下降，但是無法證實這是DNA突變引起的，因為很多因素都能影響GFP的表達，比如NgAgo影響RNA或者轉染造成的非特異的細胞脅迫狀態。針對韓春雨最近表示NgAgo的活性對於細胞污染非常敏感，作者們表示，一方面不可能所有的獨立實驗室都出現細胞污染，另一方面部分實驗室再次重複韓春雨的實驗前，已經進行了檢測並排除了支原體污染。

　　作者強調，韓春雨論文的關鍵點是用NgAgo在47個位點能進行100%的基因編輯，效率最低是21%。韓春雨組論文提供的實驗流程和他在Addgene提交的修改後流程，都沒有提到「高超的實驗技巧」。部分作者為了搞清楚原因，向韓春雨實驗室派出了客座研究人員，但是在韓春雨的實驗室，他們沒能獲得允許在其實驗室中進行哺乳動物細胞基因組編輯實驗。因此這些研究人員當面訪問韓春雨的實驗室后，並沒有獲得有效信息。

　　本文圖1意在重複韓春雨組論文的圖4，使用了和原論文相同的293細胞系和基因位點DYRK1A以及其他一些位點，嚴格按照韓春雨原始論文的實驗流程或者其提交給Addgene的修改版流程，細胞經過檢測沒有支原體污染，gDNA的磷酸化通過公司合成或者實驗室添加。T7E1實驗證明，在測試的位點均沒有基因編輯。

　　

　　圖1. 完全相同實驗條件下，無法重複韓春雨論文圖4的結果

　　在本文的補充數據部分，有更多數據分別報道了各自實驗室在相同體系中重複韓春雨的實驗、或在不同體系中擴展韓春雨實驗的結果，NgAgo均不能進行基因編輯。

　　其中，來自中科院動物所李偉實驗室的結果顯示，用純化的重組NgAgo蛋白，在37攝氏度和高溫（50度和75度），都不能在體外切割雙鏈DNA，而作為對照的TtAgo和MpAgo（已經被2014年荷蘭實驗室《自然》論文報道）則能在高溫下進行DNA切割。

　　

　　圖2. 補充數據顯示純化的重組NgAgo在體外不能切割雙鏈DNA，而TtAgo和MpAgo可以切割（即無法重複韓春雨論文的圖1）。

　　黃軍就、楊輝、李勁松、周斌等實驗室則分別報道，NgAgo不能在小鼠胚胎中切割基因組。孫育傑實驗室報道，通過光學成像，NgAgo不能結合在基因組端粒上。熊敬維實驗室則報道，NgAgo不能在斑馬魚胚胎中切割基因組DNA。

　　

　　圖3. 補充數據顯示，靶向端粒序列的NgAgo不能結合基因組上的端粒，而靶向端粒序列的Cas9可以結合端粒。

　　在這篇通信中，作者們還指出，網路論壇上有一些非正式的、支持韓春雨實驗結論的討論；另外，韓春雨引用《自然》的新聞報道作為自己實驗能被重複的證據。這更引起科研人員的困惑，因為網路上的言論和新聞報道並不能被更廣泛的科學共同體獲取。因此作者們要求原始論文的作者，包括韓春雨，澄清圍繞NgAgo的不確定結論，提供全部實驗細節以重複其實驗。

　　註：《蛋白質與細胞》（Protein & Cell）是由高等教育出版社、北京生命科學院和中國生物物理學會聯合創辦的綜合性學術期刊，報道生命科學和生物醫學的前沿熱點，特別關注蛋白質和細胞研究的最新學術成果和發展動向，由清華大學教授饒子和院士擔任主編，北京生科院院長康樂院士、副院長高福院士、蛋白質科學國家實驗室主任許瑞明研究員擔任副主編，旨在為全球生命科學領域的研究人員提供一個嚴謹而開放的學術交流平台，自2010年創刊以來國際影響力日益提升，目前已經成為我國生命科學旗艦期刊之一。

賽先生