NgAgo未能在斑馬魚中進行基因組編輯，韓春雨的結果未得到重複

科學人mp2016-11-13 01:06:04

　　

　　中心法則：DNA-RNA-蛋白質 （圖片來源：網路）

　　太長不看版

　　1.關於NgAgo的新文章是以「致編輯信」形式發表在Cell Research上；

　　2.根據文章，gDNA/NgAgo系統未能在斑馬魚中進行基因組編輯，韓春雨的結果未得到重複；

　　3.但gDNA/NgAgo系統能使斑馬魚中特定基因的表達水平下調，具體機制未知。

　　（關注科學人，發送關鍵詞「韓春雨」，了解韓春雨事件始末。）

　　昨日（11月11日），自然出版社旗下英文期刊 Cell Research (《細胞研究》) 在線發表了題為《基於 NgAgo 的 fabp11a 基因敲低引起的斑馬魚眼睛發育缺陷》的論文，通訊作者為江蘇南通大學神經再生重點實驗室副教授劉東。自韓春雨今年5月在《自然-生物技術》發表 NgAgo 基因編輯技術之後，這可能是第一篇通過正規途徑發表的有關 NgAgo 的學術論文。論文發表后，多位同領域科學家隨即接受《賽先生》採訪，對此論文進行點評。

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　　這篇論文是否

　　證明了韓春雨工作的可重複性與重要性？

　　李大力（華東師範大學生命科學學院研究員）、程臨釗（約翰霍普金斯醫學院 Edythe Harris Lucas and Clara Lucas Lynn 講席教授）、王皓毅（中科院動物研究所研究員）、谷峰（溫州醫科大學教授）、魏文勝（北京大學生命科學學院教授）、黃志偉（哈爾濱工業大學教授）等多位科學家共同表示，該論文並沒有重複出韓春雨實驗的結果，沒有觀察到基因編輯現象。

　　程臨釗認為，這篇關於斑馬魚的文章講的是基因敲低現象，很明顯，這並沒有為韓春雨報告的基因編輯技術提供任何新證據。他說：「該論文並不是對韓春雨文章的驗證。」

　　魏文勝稱，這篇文章表明在斑馬魚中NgAgo不能造成鹼基插入與缺失，仍然無法實現基因編輯。

　　谷峰則非常直接地表示：「這篇文章證明，韓春雨報道的基因組編輯工具 NgAgo 無法對斑馬魚基因組進行編輯。」

　　文章作者之一王永明（復旦大學生命科學學院研究員）稱：「我們的文章是在斑馬魚里做的。結果顯示不能切割 DNA，但是可以抑制基因表達，我們推測是結合到了靶基因上並阻止其轉錄，這並沒有支持或者反駁韓春雨教授的結果。」

　　對此，李大力和王皓毅均表示，論文中描述的抑制基因表達的「敲低」有多種可能的機制，論文作者「推測」其機制與 DNA（抑制轉錄）有關，但沒有給出任何證據表明這一點。因此，該論文與韓春雨提出的基因編輯技術並無直接關聯。

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　　韓春雨的 NgAgo 論文發表之後的第一個月，好幾個實驗室都宣稱在細胞中觀察到了「基因編輯」，後來在測序之後又紛紛否定之前的結論，是否與這次報道的「基因敲低」（knockdown）有關？

　　王皓毅評論，這是很有可能的，但是不做系統對照實驗（control）的話，很難區分是 gDNA 單獨起作用還是 NgAgo 在起作用，所以並沒有確定的結論。他認為，在斑馬魚中觀察到的可能是瞬時的基因敲低（knockdown）效果。他本人實驗室做過的唯一的功能相關實驗是 Hprt 基因的敲除，但因 6-TG（6-巰基嘌呤）的篩選實驗過程比較長，可能觀察不到瞬時敲低的效果，而 CRISPR技術的敲除實驗則有很明顯的變化。

　　魏文勝表示，他的實驗室利用 NgAgo 在初期也觀察到了某些表型變化，但之後意識到這只是基因敲低的結果，而非基因敲除。敲低本身並不令人驚訝，因為 Agonaute 蛋白在真核細胞中就是通過 RNA 來介導基因敲低。

　　北京大學分子醫學研究所教授熊敬維則說，他們嘗試過4個斑馬魚基因的突變實驗，有一個基因有表型，但沒有發現突變，就放棄了。另外，他們還構建了 FokⅠ-NgAgo 融合蛋白來研究 NgAgo／gDNA 是否在 293T 細胞中有介導靶基因突變的功能，他們研究了3個靶基因，沒有發現突變，這個實驗也不支持 NgAgo 有基因編輯功能。

　　此外，谷峰表示，在他們實驗室 NgAgo 的實驗里既沒有觀察到基因編輯，也沒有觀察到基因敲低，所以對此不予發表評論。

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　　那麼到底什麼是基因敲低和基因敲除？

　　與基因（組）編輯有什麼區別？

　　簡單說來，我們的生命活動基本由蛋白質作為機器來完成（RNA 的功能也正在越來越多地被發掘），根據中心法則「DNA-RNA-蛋白質」最簡化的套路，如果想抑制某個蛋白的功能，可以從 DNA、RNA、蛋白質三個層面進行調控。在 DNA或者基因組水平的調控是最徹底的，基因組編輯（genome editing）即對基因組上的目的基因進行刪除、突變、或插入，歷史上沿用至今的常用工具包括ZFN（鋅指蛋白酶）、TALEN 和 CRISPR。在RNA層面的編輯最常用的是RNA干擾，通過抑制RNA的轉錄或者促進 RNA 的降解從而降低 RNA 水平，影響其翻譯成蛋白質以及相關性狀的發生，被稱為「敲低」（knockdown）。

　　

　　中心法則圖示。（圖片來源：網路）

　　魏文勝和谷峰則強調：knockdown（敲低）與knockout（敲除）是完全不同的兩個概念。基因敲低是將基因表達水平下調，而不涉及靶基因 DNA 本身的變化，基本是不可遺傳的。基因敲除屬於基因（組）編輯技術，必須是在基因組水平上造成突變，破壞基因讀碼框，消除整個基因的表達。一般來說，在受精卵水平的基因編輯變化能夠穩定地遺傳給下一代。敲低與敲除二者最明顯的區別是基因組DNA序列是否發生變化。

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　　《細胞研究》論文本身亦存在缺陷

　　在接受《賽先生》採訪的過程中，各位科學家一致表示，這篇研究斑馬魚胚胎髮育的文章存在一些不嚴謹之處，比如主要結論的機制沒有直接證據，有必要添加更多的對照實驗。

　　王皓毅說：「我理解的 knockdown 是三種可能：結合在 DNA 上去抑制轉錄，阻止轉錄起始或者轉錄延伸；或者結合在 RNA 上，直接導致 RNA 降解；或者結合在 RNA 上，影響或抑制 RNA 的翻譯。按照這篇文章的說法，他們猜測是第一種情況，即結合在 DNA 上抑制其轉錄，這篇論文數據雖然與這個設想一致，但沒有提供直接證據確認這個機制。」

　　為了更好地揭示機制，幾位科學家也提出了自己的建議。王皓毅建議添加一組沒有5'磷酸化的 gDNA 對照，因為理論上來說 NgAgo 要和 5'磷酸化的單鏈 DNA 結合。另外，他建議詳細檢測 NgAgo-gDNA 注射組的下一代表型，以確認表型是否可遺傳到下一代。

　　中科院上海生科院神經科學研究所楊輝研究員則建議將 fork1 接到 NgAgo 後面，看是否能切割 DNA，這是直接證明 NgAgo 有 DNA 特異性結合的能力；同時做 DNA 標記實驗，將 NgAgo 和 GFP 融合，看是否能標記 DNA 特異性位點，如端粒等，這也是 NgAgo 能特異性結合 DNA 的證據。上述實驗在ZFN，TALEN，CRISPR 的各種版本，如 Cas9，saCas9，NM 中都得到了很好的驗證。

　　另外，北京大學孫育傑教授早先的研究結果顯示，NgAgo 不能與基因組的 DNA結合，因而這篇文章推測「結合」其實是缺乏直接證據的。

　　魏文勝指出，論文的結果表明其所發現的機制區別於RNAi，因為針對正向和反向兩條鏈設計的單鏈DNA都能夠實現NgAgo介導的敲低效果，的確可能作用於細胞核內的基因組上。一個好的對照實驗是拿掉NgAgo的入核信號肽（NLS），看看是否仍然有作用。

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　　該如何看待《細胞研究》發表此論文？

　　面對該論文，林碩（美國加州大學洛杉磯分校教授）、魏文勝等多位科學家均表示，同仁們應仍舊關注韓春雨發表在《自然-生物技術》雜誌的數據。

　　谷峰介紹說：「之前實名表示不能重複的科學家們已經停止了相關的重複工作，之前的陰性結果應該會於近期在學術期刊正式發布。現在大家都在自己的領域繼續做包括新型基因組編輯工具的研發和優化的工作。」

　　魏文勝提出，要分清楚兩個事情：一個是包括 NgAgo 在內的 Agonaute 蛋白家族本身關聯的科學問題，裡面有趣的分子機制和應用潛質值得研究者繼續發掘；另一個是有關韓春雨論文的科學性及重複性問題，二者不能混為一談。讓科學回歸科學。