韓春雨：曾重複實驗兩次 第三方立即調查是最大危機

　2016年10月18日 09:06  　文章來源：知識分子微信公眾號

　　「他們要是願意實名出來，我們就讓重複實驗成功的人實名出來。」韓春雨這番針對實驗重複失敗的科學家的話，10月10日早上出現在《韓春雨就「重複實驗失敗」答科技日報記者問》一文中。

　　當天晚上10時47分，中青在線率先報道了北京大學教授魏文勝等12名學者實名公開他們沒能「重複」出韓春雨的實驗，其實驗方法「讓人懷疑」的消息。

　　15分鐘后，在與《知識分子》的電話連線中，韓春雨表示不希望公布重複出他NgAgo實驗結果的實驗室。他表示，「學校（指河北科技大學，編者注）跟我一樣，是明確知道哪幾家（實驗室）做出來了，和實驗室都有接觸」，「我不會說出他們的名字，但過一陣你會知道」。他補充說，「擔心他們受到媒體騷擾」，「我不能讓人家當擋箭牌」。

　　「別人認為這對我是一個信譽危機，我不認為，我認為這就是一個學術問題。他們（指聲明實驗重複失敗的科學家）說做不出來，我去解決他們的問題，這是很正常的。這不涉及信譽危機。」韓春雨在電話中說。

　　將近1小時的通話結束后，韓春雨說自己還要接著做實驗。次日（10月11日），《知識分子》應約來到位於石家莊槐北路43號的河北科技大學韓春雨實驗室。中午時分，韓春雨接受了《知識分子》的訪問。

　　

　　槐北路43號，韓春雨任教的河北科技大學門牌。攝影：陳曉雪

　　自稱兩次重複，「我的實驗沒問題」

　　在河北省藥用分子化學實驗室二樓的一個會議室，不等《知識分子》提問，韓春雨首先表明態度：「重複率低和不能重複是兩碼事，重複率低不代表不可重複。這兩個是本質的差別。」

　　他進一步表示，「小保方晴子那個（實驗）是全球沒有一家做出來，然後學術委員會才介入調查，而我這個是明明有人能做出來，我們學校其實還找過其他幾家實驗室，有確鑿的證據，因為（他們）是做出來感興趣來聯繫我們，然後我們有一些技術、有一些改進，可以跟他們分享。」

　　據韓春雨講述，自己是在7月份聽到國內外大面積不能重複自己文章結果的事情，也曾經懷疑過自己：「是不是我做錯了」。當《知識分子》追問「錯了」的含義， 「可能看到的是一個假陽性結果」，韓春雨解釋說，但強調「這個得用實驗來說明。我現在基本能確定不是我實驗室材料的事，發文章用的實驗材料是沒有問題的」。

　　韓春雨否認此前曾對《科技日報》記者講過，自己「論文發表之前按要求重複過實驗「（《科技日報》10月10日報道），而稱「目前沒有收到（《自然·生物技術》）編輯部要求做可重複實驗，（編輯部）也不會提出這樣的要求」，但自己確實在論文發表后成功重複過兩次實驗。「一次是在論文發表后，一次是在前一段時間，都在一周左右的時間完成。」

　　當被問及是否《科技日報》記者編造了訪談內容時，韓春雨表示，「他（系指《科技日報》記者，編者注）的這個理解是錯的，而且我反覆說，不要去報道」，「我一般腦子裡都在想著實驗怎麼去做，跟你們說這些事情的時候，我不是專門的新聞發言人，無法做到特別準確」。

　　「也就是說，有可能是你說錯了？」《知識分子》問道。

　　「說錯了，這是很正常的。」韓春雨回應。

　　「那還有哪些地方是你說錯了的？」《知識分子》追問。

　　「……」韓春雨低頭笑了笑，「這是一特燒腦的事兒」，之後不再回應，轉而繼續強調：第一，實驗是可重複的，只是重複率低；第二要通過實驗去找到重複率低的原因；第三，NgAgo目前遇到的困境與相關背景研究少，與Cas9作為基因編輯工具前已有較為充分的研究不同。

　　然而，通常生物學實驗不能重複的原因可能很多，找出別人不能重複實驗的所有原因幾乎是不可能完成的。而韓春雨自己也承認，「如果這個原因好找的話，那12個科學家早就找出來了」。

　　但與此同時，他拒絕自己的實驗室公開做重複實驗，對於這種「自證清白」的做法，韓春雨認為「這個事如果去做的話就是一個有罪推論的事情」。他說，「我實驗室本來很小，推進就很慢，這樣就會幹擾我實驗室的正常運作。（這件事）有更好的辦法可以解決。我希望找出確鑿的（細胞）污染源，這樣的話別人也能做出來。」

　　對於外界猜測其可能造假的有關說法，韓春雨曾在10月10日晚上的電話里表示：首先我沒有造假，其次我想弄清楚我的實驗是否不嚴謹，我現在基本上有初步的實驗結果，我的實驗是沒有問題的。

　　當《知識分子》求證其是否「能夠重複自己的實驗，而且實驗結果不是假陽性」時，韓春雨表示，「這個還是比較能確定的。之前我沒有做實驗的時候我不能說這些話。我還是因為前一段時間做了實驗，才能有這個判斷，才敢跟你說這個話。」

　　但對於「是否完全排除假陽性結果」的追問，韓春雨的表態顯得謹慎了一些：「應該說，我還要再進一步把它確實了，也許我應該用發文章的方式把它公開。」

　　細胞污染疑雲

　　國內外大量實驗室為何無法重複其實驗？ 「細胞污染」是韓春雨向同行和媒體常說的一個原因。

　　「別人可能會有疑問，怎麼這麼多人手裡的細胞都是有問題的？我也從各種渠道購買，或者也從別人手裡要了實驗材料，把原來整個實驗捋一遍，做一遍，確實發現，他們說做不出來確實是有原因的，我現在基本上確認其他實驗室不能重複出來實驗的一個很重要的原因是細胞污染，但我還要通過更嚴謹的實驗去把這些東西找出來。」韓春雨解釋道。

　　「細胞污染是一個挺嚴重的事情，它曾經對世界上很多科學家造成困擾，Nature有過專門的報道。」韓春雨強調說，「我做這個事情就是對12個實名科學家的回應。」

　　目前，韓春雨集中精力「在分析判斷別人的（實驗用）細胞和我手裡的細胞」，「我希望找出確鑿的污染源，這樣的話別人也能做出來」。

　　據韓春雨實驗室的一位工作人員說，韓老師每天都在實驗室泡著，晚上很晚才回家。在與《知識分子》通電話的當晚，一直工作到次日凌晨三點。

　　韓春雨告訴《知識分子》，自己目前最主要的時間都花在做實驗上，「但是做實驗的時間也不多」，「我整個八月份幾乎沒法在實驗室幹活，總有電話，會有記者堵門」。「我需要時間，需要一個安靜的環境」。

　　當《知識分子》再次問及在其成功重複的兩次實驗中，是如何處理細胞污染問題時，韓春雨表示，自己在發《自然·生物技術》論文之前也遇到過類似的細胞污染的問題，但拒絕透露自己解決問題的「秘訣」，「我只能說將來我會以比較嚴謹的科學報告的方式去（回應）」。

　　究竟誰重複了實驗？

　　2016年8月，經歷國內外多家實驗室無法重複實驗的質疑高峰后，韓春雨接受了自然新聞亞太通訊員David Cyranoski的採訪，並提供了5位據稱可以重複實驗的中國科研人員名單。

　　最終有三位匿名的中國科研人員出現在自然新聞的報道中。其中一位表示在好幾個細胞系檢測了NgAgo系統，而且結果顯示NgAgo能夠在預期的位點誘導遺傳突變，但NgAgo系統的效率並沒有比CRISPR-Cas9高，可能還要後續調整改進。另有兩名科學家稱有了一些初步的試驗結果顯示NgAgo是有效的，但是仍然需要進一步測序去確認。

　　9月6日，《成都商報》刊發了對韓春雨的專訪，韓春雨稱「《自然》雜誌已經證實實驗可重複，但還有不確定因素影響實驗結果」。 隨後，David Cyranoski本人表示自然新聞的報道不能作為韓春雨實驗可重複的證據。

　　究竟是誰已經重複了實驗，韓春雨對此一直諱莫如深，不願多談，只是聲稱河北科技大學也「明確知道哪幾家（實驗室）做出來了，和實驗室都有接觸」。

　　當《知識分子》追問：能夠重複的實驗室是如何解決細胞污染問題的？韓春雨欲言又止，表示這一問題「涉及到人家的機密」，並補充道：「都是在某些特別乾淨的細胞里做出來的」。

　　在接受《知識分子》訪問時，韓春雨拒絕公開究竟誰重複了實驗，理由是「因為前一段媒體報道，做出來就會被騷擾一通這個事很不好」。

　　事實上，由於外界普遍不知哪個實驗室重複韓春雨實驗結果成功，這樣的騷擾是否發生無法求證。韓春雨堅持認為公開已經重複實驗的實驗室並不是好辦法，他向《知識分子》描述了心目中解決問題的最好辦法——自己做實驗「解決掉一些問題，或者提出一個辦法」，再找另外的第三方實驗室重複實驗，既保全目前「已經重複實驗」的合作夥伴，又解決大家不能重複存在的問題。

　　韓春雨說，這一過程「大概需要20天時間左右」， 「20天的時間可以發生很多事情」，但他不願詳談具體會發生什麼。

　　回應13位實名科學家：他們應該幫我

　　對於韓春雨論文中NgAgo實驗的結果，韓春雨堅持它是「可重複」，只是「重複率低」。重複率低是什麼概念？韓春雨的解釋為：「重複率低是能做出來的，但是很多人做不出來。」但是，他又補充說，到目前為止，他並沒有看到一個相關的科研的定義。

　　《知識分子》詢問，在發表論文之前是否碰到過重複率低的問題，韓春雨坦言，「這個之前沒有碰到過」，但同時表示，「這是一個我特別不願意去回答的一個問題」，原因是擔心被人誤讀。

　　韓春雨稱使用自己培養的細胞能夠高效地實現NgAgo基因編輯，而從「某些權威機構買來的細胞確實有很大的問題」。

　　談到所謂「高超的實驗技巧」，韓春雨解釋道，他在論文中論述過，不同的細胞表達NgAgo蛋白的速度、高峰期不同，而Ago必須一邊表達一邊與guide （指guide DNA）結合，而不像Cas那樣的可以隨時結合guide，一旦錯過這個窗口期，Ago表達過了沒有結合guide，再結合它就沒有活性了，因此它的效率將會降下來，這是一個操作的難點，需要花一番力氣摸索。

　　在發表論文前，韓春雨自述曾用兩到三個月的時間讓實驗做到高效，他同時表示，「當時就沒想到細胞污染這事，因為當時我們細胞是不污染的。」

　　但當被問到有沒有實驗記錄以佐證其實驗成功率時，韓春雨說，「我們的條件非常有限你知道的，有時要用公共實驗室的（儀器）。我們只是把數據掃在電腦上，有些是能掃的有些是不能掃的。」

　　「也就是說，實驗記錄並不是完整的？」面對《知識分子》的提問，韓春雨再次迴避：我們實驗室很窮。這個我絕對不能在外面這麼說。

　　談到迄今共計13位沒有重複實驗的國內同行實名質疑，韓春雨表示，「全世界的科學家都會面臨重複性的問題，包括Cas9也有這個重複問題。因為直到現在，也有些實驗室一直做不出來，或做不好。他們知道我是有重複的，應該幫助我一塊解決這個重複率低的問題。不應該讓我一個人去幫助他們那麼多人。」

　

　「實際上，只有你和河北科技大學知道哪幾個實驗室是能重複的。這13位科學家是不知道的。」《知識分子》再次問及「實驗可重複」之謎。

　　韓春雨說：「這個……在適合的時機……，而且他們也從來沒有聯繫過我，如果他們單個人聯繫我的話，我會告訴他誰誰誰做得出來。我們可以私下商量。但是他們從來沒有找過我。」

　　《知識分子》繼續問道：「是不是說，請一位科學家今天來聯繫你，你可以跟他講一講，誰重複過這個實驗？」

　　韓春雨回答：「嗯。他可以來我的實驗室。好多是北京的離這麼近，他直接來就行了。一起來解決重複率低的問題。這個我會特別高興的，這是我特別希望的。」

　　《知識分子》追問：「這麼長時間以來，大家都有質疑，但他們都沒有跟你聯繫過嗎？」

　　韓春雨回答：「當時還是不少人來實驗室的，要走質粒，然後我也會說一些技術細節。但我那會兒也不知道（不能重複）是（細胞）污染造成的。說實話，那段時間那麼忙亂，也沒法做實驗，都在應酬這個。後期是被騷擾無法做實驗。自從那次去北大（指5月27日韓春雨應魏文勝之邀在北大作報告）之後回來，這些人都沒有和我聯繫過。」

　　第三方立即介入調查將是「最大危機」

　　8月9日，河北省發展和改革委公示「原則同意」河北科技大學基因編輯技術研究中心建設工程項目建議書，批複公文顯示，該中心總建築面積2.52萬平方米，總投資達2.24億元。

　　9月23日，澎湃新聞報道稱，該中心2000萬設備招標被舉報存在暗箱操作。

　　對於此事，韓春雨的回應是，「這些我都不參加。現在學校能運作就讓學校運作了。主要我在實驗室幹活，光這個就不夠幹了。」

　　而對於當前各方呼籲的第三方調查能否發生，韓春雨再次強調，「重複率低，不是不可重複，它是兩回事。就是什麼調查之類，是不可重複才要進行的事情。」

　　「最大的危機是，還沒等我弄清楚這些問題時，第三方就介入調查，這個我就麻煩了，因為我得去把這些問題搞清楚，第三方調查時間很長，才能搞清楚。我希望我有了結果之後，直接找第三方重複實驗，這是最好的。」韓春雨說。

　　在近兩個小時的訪談最後，《知識分子》問道：如果最後驗證實驗真的假陽性結果，你怎麼辦？

　　「如果是假陽性，連編輯基因組這件事都不能做，我肯定撤稿，如果有部分假陽性，我申請更正。這都是正常的，我發現實驗中有問題，我就去更正，這在科學中也經常發生。」韓春雨說。

　　韓春雨NgAgo論文可重複性爭議考驗科學界

　　

　　韓春雨的實驗室在河北科技大學槐北路校區，而不是生物科學與工程學院所在的新校區，韓春雨辦公室的工作人員介紹說，這是因為韓春雨的家就在附近，為了做實驗方便。攝影：陳曉雪

　　總述

　　今年5月，因為一篇刊發在《自然·生物技術》的論文，河北科技大學副教授韓春雨以一夜成名的姿態進入公眾的視野，一方面其論文報告了一種可以與國際生物學界流行的基因編輯技術CRISPR-Cas9相媲美的新的基因編輯工具，另一方面也因為韓春雨本人之前籍籍無名，而他所在的單位河北科技大學長時間處於科研前沿的窪地，少有重大科技成果的產出。

　　研究成果的重要性與研究者背景之間的強烈反差，讓這一故事充滿戲劇性，令人倍感振奮。

　　《知識分子》較早以特稿形式報道了韓春雨發表的這篇突破性論文，多家媒體也紛紛趕到河北科技大學採訪韓春雨實驗室；協和醫學院、北京大學、浙江大學等高校或研究機構邀請韓春雨做報告；有的實驗室直接派人飛到河北石家莊，第一時間與韓春雨實驗室建立聯繫……

　　然而，這一被寄予厚望、獲得高度評價的研究很快備受質疑。

　　距離韓春雨論文發表不到一個月，有人在網上稱做重複實驗一周無法看到論文報道的結果；質疑接踵而至，國內外多家實驗室紛紛報告無法重複韓春雨實驗或在其他細胞系內檢測不到NgAgo基因編輯的效果；10月10日晚，12名中國科學家實名通過媒體發表聲明，稱經過多次實驗無法重複或再現韓春雨論文的結果……

　　今年7月底，《知識分子》注意到韓春雨等人文章面臨的可重複性爭議，開始陸續詢問國內外多位曾經測試過NgAgo基因編輯活性的科學家，其中不乏基因編輯領域的小同行。他們介紹了自己實驗室測試NgAgo的過程與結果：

　　8月1日，中國科學院動物研究所的研究員王皓毅稱，他的實驗室首先在小鼠中對NgAgo進行測試發現「不工作」，之後對韓春雨論文的實驗進行了部分複製， 「一開始有一點點陽性結果，但後來重複就重複不出來了」。

　　8月1日，北京大學生命科學學院研究員魏文勝稱，他的實驗室在對韓春雨的論文進行多次重複之後，「實驗結論是完全不工作，沒有任何疑慮的不工作」。

　　8月2日，美國霍華德休斯醫學研究所的大衛·斯特恩（David L。 Stern）稱，他的實驗室在果蠅中對NgAgo進行了測試，「不像論文中說的那麼有效」。

　　8月2日，澳大利亞國立大學的科學家加埃唐·布爾焦（Gaetan Burgio）稱他在小鼠身上沒有看到NgAgo編輯基因的效果。

　　9月28日，美國有教授稱，他利用NgAgo試圖在細胞上和小鼠上編輯基因的三次實驗全部失敗。他不願公布自己的名字和所屬機構。

　　10月6日，荷蘭瓦赫寧恩大學的微生物學家約翰·范德歐斯特（John van der Oost）稱，到目前為止沒能再現韓春雨論文結果。

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　　無可爭議的是，韓春雨發表在《自然·生物技術》的實驗結果的可重複性存在巨大的爭議，而且到目前為止，《知識分子》所聯繫到的國內外十餘家實驗室沒有一個表示自己已經可以完全重複或再現韓春雨論文的結果（其中一些實驗室在談完后要求匿名或不做公開報道）。

　　在此，《知識分子》選擇披露這一歷時數月向學術界求證的歷程，旨在記錄這一段爭議的歷史，並期望這一事件最終按照科學的規範得到合理的解決。

　　在本文中，我們關注的核心問題是：

　　韓春雨《自然·生物技術》論文的實驗結果是否可以被重複和驗證？

　　一項新的研究遭到眾同行質疑，一個科學的解決方法應該是什麼？

　　一

　　2016年5月2日，河北科技大學副教授韓春雨與合作者在《自然·生物技術》報告了一種新的基因編輯工具NgAgo，能夠在哺乳動物的細胞中編輯基因組的DNA。

　　這一研究甫一出現，就在中國科學界引起了巨大的轟動，不僅僅在於韓春雨等人找到了一種新的基因編輯工具，更在於論文報告的NgAgo所呈現出來的潛在能力。

　　在此前的研究中，具有酶切活性的Ago蛋白都是從嗜熱菌中發現的，只有在65°C以上的高溫環境下才能生效，因此無法在哺乳動物體內使用而應用價值不高，而韓春雨的論文則找到了一種可以在常溫下（37 °C ）實現基因組編輯的Ago同源蛋白，使其展現出了廣闊的應用前景。

　　在此之前，CRISPR-Cas9是基因編輯領域的明星技術。自2012年問世以來，CRISPR-Cas9經過不斷的改進，因其操作簡便、功能多樣，已經成為生命科學領域近些年來最為重要的技術突破。世界範圍內的實驗室使用它精確編輯植物、動物、甚至是人類的基因組，而風險投資也看中了它在農業、醫藥、生物燃料等領域的潛力，多個基於CRISPR-Cas9技術的公司創立，其中以麻省理工學院教授、博德研究所核心研究員張鋒參與創建的公司Editas Medicine、加州大學伯克利分校的詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）創建的Intellia Therapeutics以及瑞典女科學家埃馬紐爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）與人聯合創辦的藥物研發公司CRISPR Therapeutics最受關注，前兩家公司已上市，最後一家亦是IPO進行時。

　　韓春雨等人的研究展示了NgAgo作為一種新的基因組編輯工具的多項特性，可以減少脫靶效應的發生，並且NgAgo有著與CRISPR-Cas9可以相媲美的效率，甚至某些時候效率更高。

　　在NgAgo身上，人們似乎看到又一個明星技術呼之欲出。

　　5月7日，韓春雨向《知識分子》表示，現在的NgAgo「還是最原始的版本，和Cas9剛出來的時候是一樣的，以後也會有全世界的實驗室對它進行改進的」，他還透露，正在進一步優化NgAgo，並準備在有了新的進展之後投稿。

　　二

　　韓春雨論文發表后，世界各地的實驗室對NgAgo充滿了熱情，許多實驗室在第一時間投入到測試NgAgo的實驗中，但質疑聲也隨之而來。

　　5月27日，在最早討論韓春雨工作的論壇未名空間（mitbbs.com），一ID為「zhouyangq」的用戶稱，經過一個星期的重複實驗，未看到韓春雨《自然·生物技術》論文中報道的結果。

　　此後，網上開始不斷出現聲稱不能重複韓春雨論文結果的帖子。7月29日，澳大利亞科學家布爾焦公布自己測試NgAgo的實驗過程，表示不能重複韓春雨論文中的Fig.4（圖4）的結果。

　　加埃唐·布爾焦博士是澳大利亞大學約翰·克汀醫學研究中心（the John Curtin of Medical Research）一個研究小組的負責人，同時也是澳大利亞表型組學設施中心（Australian Phenomics Facility）基因改造設施中心的負責人。布爾焦的實驗室主要利用下一代測序技術、CRISPR-Cas9基因組編輯等前沿遺傳學技術，研究小鼠模型研究宿主與病原體之間的互動。

　　和很多人一樣，《自然·生物技術》刊發韓春雨論文那天，布爾焦了解到NgAgo。「我認為這個結果非常有趣，值得一試，這可能對實現我們的基因組編輯工作有用。」8月3日，布爾焦8月3日通過郵件告訴《知識分子》。

　　韓春雨論文結果顯示，NgAgo可在人體細胞中進行基因編輯。布爾焦的實驗室沒有選擇重複韓春雨論文中的實驗，而在小鼠胚胎中測試NgAgo的基因編輯效果。布爾焦說，他希望能夠比較NgAgo與CRISPR，評估NgAgo的表現是否可以用於實驗室的研究工作。

　　7月15日，布爾焦在推特上發表了一組數據，認為自己確認再現了韓春雨的實驗結果，但隨後遭到很多同行的質疑。布爾焦告訴《知識分子》，他在推特上公布的這一圖片起初似乎提示基因組被編輯了，但當通過進一步測序，他發現「絕對可以排除編輯基因組的這個選項」。

　　「我沒有在人體細胞中重複韓春雨的工作，但我在中國和其他地方的一些同行進行了重複，但不幸的是沒有成功。」布爾焦說。

　　7月29日，布爾焦發表博文稱，他的實驗室過去兩個月嘗試以小鼠為動物模型對NgAgo進行測試，發現NgAgo無法在小鼠受精卵實現編輯基因組的效果。他一併公布了其測試NgAgo的整個過程以及部分實驗數據。

　　布爾焦測試NgAgo的經歷被國內多家媒體報道引用，一時對於韓春雨實驗不能重複或重現的質疑達到頂峰。

　　布爾焦強調說，他並不認識韓春雨，沒有見過韓春雨本人或他的團隊成員，也沒有和韓春雨有過任何的郵件來往或其他互動。

　　「更重要的是，我絕對沒有反對中國科學。我在中國有很多科學家朋友，他們都非常聰明、智慧、出色。」布爾焦說，他並不是反對NgAgo，也與CRISRP和NgAgo之間的戰爭無關，發表那篇博文是想開放自己的實驗，讓每個人都可以評論，提高自己的工作。

　　一位在美國某生物醫學實驗室做研究的博士后看到布爾焦的博文後說，「（實驗）桑格測序的深度不夠。看Ago有沒有編輯效果，應該做靶點測序，並且要有平行的陰性對照。另外，他的博客上沒有顯示出陽性對照，同樣的靶點位置，設計一個Cas9的sgRNA，同樣的實驗手段，然後進行肩並肩（side by side）的比較，才更有說服力。」

　　《知識分子》把這些意見也反映給了布爾焦。他表示，這些桑格測序的曲線顯示出模糊（的噪音），這不可能是編輯的結果；同時，他也以CRISPR做了陽性對照和陰性對照，只是在博文中沒有貼出來。

　　「到目前為止，這還是一個非常正向的實驗。很多人就我實驗中的錯誤、應該如何做實驗提出建議。這通常發生在發表一篇科學論文的同行評議過程。在這裡，我已經決定，不追逐期刊發表，而是和每個人分享我的數據。這是一個開放同行評議的過程。」布爾焦說。

　　布爾焦表示，他現在還不確信NgAgo是否能夠或不能夠編輯。「它確實對細胞發生了作用，但我對NgAgo如何工作仍感到困惑。它未來也許會是一個潛在的基因組編輯工作，但目前仍需要大量的改進。」布爾焦說，「現在，我的感覺是堅持CRISPR-Cas9，等待NgAgo更多的發展。」

　　8月4日，布爾焦博士給《知識分子》的郵件回復中表示，他仍在繼續做實驗測試NgAgo，「我之前的實驗有一些要素（elements），我正在嘗試著去理解它們。」 8月5日早晨，布爾焦更進一步回復說，「看看這個酶到底有什麼功能」。

　　10月17日，布爾焦告訴《知識分子》，為了檢測實驗中出現的indels是NgAgo導致的還是隨機擴增引起的，他還在繼續嘗試NgAgo，並對韓春雨在Addgene上提供的質粒做了一些改進，在細胞系和小鼠受精卵中檢測基因編輯的效果。「這將需要幾周去完成。」同時，因為他自己已經放棄了NgAgo這一技術，「檢測NgAgo在我的實驗室優先權非常低」，「進展緩慢」。

　　三

　　7月29日，布爾焦關於NgAgo實驗的博文發表不久，西班牙高等科學委員會（CSIC）下設的國立生物技術中心（Centro Nacional de Biotecnologia）的科學家路易斯·蒙特柳（LIuis Montoliu）在推特（twitter）上轉發了他的博文：「讚譽送給布爾焦，他分享了自己的經歷，對基因編輯來說，NgAgo不像當初預期的那麼好使。」

　　資料顯示，蒙特柳是位於西班牙的國際轉基因協會（ISTT）的共同創始人，並從創立到2014年擔任該協會主席。蒙特柳的實驗室主要做哺乳動物基因組和轉基因動物研究。

　　蒙特柳在推特上說，在NgAgo之前，他的實驗室曾花了近兩年時間嘗試測試TtAgo（Ago家族的一種蛋白），但無法實現基因組編輯。他在推特上說，「在布爾焦和眾多（實驗室）使用NgAgo出現相似的陰性結果后，《自然·生物技術》應要求原文作者分享原始數據和（實驗）條件。」

　　隨後，網上開始流傳蒙特柳發給國際轉基因協會成員的一封郵件，郵件名為「對Ago非常失望：CRISPR萬歲！」郵件說，6月初，NgAgo通過全球科學家質粒共享非盈利組織Addgene發布后，蒙特柳的實驗室就開始嘗試這一新工具，「但是不久發現事情不對」，NgAgo不像報道的那樣起作用。「在科學和技術層面我完全信任的一些同行開始認為，他們無法重複韓的論文結果。」郵件顯示。

　　郵件中還有一句話被加粗：「NgAgo在哺乳動物細胞內不能編輯基因」。

　　7月31日，蒙特柳的郵件被多家媒體報道引用。

　　8月3日，《知識分子》郵件聯繫了蒙特柳教授，詢問郵件的真實性，以及郵件中顯示的一個針對CRISPR與NgAgo效果的調查來源。

　　蒙特柳回復說，他不評論為了科學目的發送給協會內部的私人信息，「這些郵件都沒有打算公開投遞，卻未經許可發表在了公共領域」。

　　根據財新傳媒的報道，蒙特柳對NgAgo進行了初步測試，但他很快意識到，實驗的結果與韓春雨文章描述的不一樣。

　　「我認為韓春雨博士的工作表現得非常令人激動，充滿希望。他在《自然·生物技術》發表的論文令人信服地表明NgAgo可以進行基因編輯。我們都祝賀他的這一工作。然而不幸的是，世界範圍內的許多實驗室目前的證據認為，NgAgo不能正常工作。我希望這種情況可以得到解決，科學地解決，很快地解決。」蒙特柳在給《知識分子》的回復中說。

　　四

　　7月29日，美國科學家大衛·斯特恩（David L。 Stern）也在推特上轉發了布爾焦的博文，「NgAgo不像說的那樣有效。（布爾焦的結果）和我在果蠅上的初步結果一致。」

　　斯特恩是美國霍華德休斯醫學研究所（Howard Hughes Medical Institute）的遺傳生物學家。他的實驗室位於美國維吉尼亞州勞登郡的珍利亞農場研究園區，主要研究果蠅的形態演化與發育生物學。

　

　8月2日，《知識分子》和斯特恩博士取得了聯繫。

　　斯特恩在郵件回復說，他5月上旬讀到了《自然·生物技術》發表的韓春雨關於NgAgo的論文。之後，他的實驗室就開始著手準備使用NgAgo編輯黑腹果蠅的基因組。

　　斯特恩博士向《知識分子》描述了實驗的過程。他首先合成了經過果蠅密碼子優化的NgAgo，將其克隆到表達載體中。之後，他在體外轉錄了NgAgo的mRNA並將其注射到果蠅胚胎中。同時，他還訂購了磷酸化的 gDNA，而這段 gDNA能夠靶向一個之前被證實過的適合 Cas9編輯的位點。他將注射了靶向 Ubx 基因的 Cas9的 mRNA和 gRNA作為對照，在另外一組胚胎中注射了靶向相同位點的 NgAgo的 mRNA和 gDNA。「實驗中的mRNA都按相同的濃度注射，gRNA和 gDAN也按照相同濃度注射。」斯特恩說。

　　斯特恩發現，所有注射Cas9的胚胎都長出了突變的個體，而注射了NgAgo的胚胎沒有一個出現突變的表型。隨後，斯特恩又將這些果蠅又傳了一代，每個注射了Cas9的個體都產生了突變的後代，而注射了NgAgo的後代則都沒有產生突變的後代。

　　「NgAgo是否像發表的一樣有效，我沒有確切的數據，因為我沒有嘗試精確複製論文中的實驗。在一些條件下，NgAgo也許能夠在gNDA的介導下精準地切割DNA。」但是，「很明顯，即使NgAgo發生作用，在這樣的實驗條件下，它的效率不如Cas9」，斯特恩總結道。

　　在果蠅胚胎測試NgAgo失敗之後，斯特恩與韓春雨做了一些溝通，後者給出了幾個提高NgAgo效果的建議。但是，斯特恩說，「基於許多研究小組都沒能觀察到NgAgo能夠編輯基因組的結果，我不可能繼續使用這一工具」。

　　五

　　「當時看到這篇文章非常驚訝，而且激動，因為第一眼看到這篇文章的data（數據）是almost too good to be true（幾乎非常好，應該是真的），我們第一反應是相信這篇文章的。」 8月1日，在成都參加第11屆華人生物學家協會雙年會的中科院動物研究所研究員王皓毅對《知識分子》說。

　　王皓毅馬上給韓春雨發了郵件和簡訊，希望建立合作，但並未得到韓春雨的回復。「他沒有回復，我也可以理解，他應該是收到各方面很多信息無法一一回復」。王皓毅回憶說。與此同時，王皓毅本人還寫了一篇熱情洋溢的文章介紹NgAgo，稱之為「一個激動人心的基因組編輯新工具」， 《中國科學》（Science China）2016年6月17日在線發表了這篇文章。

　　王皓毅的實驗室自己克隆了古菌的NgAgo基因，並且基因合成了人源化的NgAgo，開始在人類293T細胞系中嘗試文章中針對GFP質粒以及內源基因的基因編輯實驗。在經過大約一兩周的實驗后，王皓毅的實驗室發現， 「和很多同行一樣。我們看到針對GFP在質粒上的表達是有抑制效果，但對於內源基因的編輯檢測不到」。而進一步的實驗也無法檢測到GFP質粒上的突變，同時control（對照）組的結果表明單鏈guide DNA本身就對GFP表達有很強的抑制作用，因此GFP的抑制很可能是假陽性的結果。

　　之後，他派了自己的學生去韓春雨實驗室取質粒，重新在人類293T細胞系中嘗試重複利用韓春雨的NgAgo質粒進行基因編輯，但是也沒有看到韓春雨論文的結果。

　　後來，王皓毅和韓春雨一起參加在北京舉行的香山會議。說到實驗重複困難的問題，王皓毅說，韓春雨當時回答說實驗中需要注意轉染的時間，觀察的時間可能要久一點，另外做序列分析的DNA需要銀染。「我們嘗試了一些，各種不work（工作），」王皓毅說。

　　與王皓毅一起向《知識分子》介紹實驗情況的還有中科院上海神經科學研究所的研究員楊輝。楊輝的實驗室對小鼠胚胎進行了三輪實驗，用了三個不同版本的NgAgo（密碼子優化或者NLS在N端、C端），在細胞上嘗試了韓春雨論文中的兩三個基因，操作了幾百個胚胎，「但是沒有效果」。

　　魏文勝第一次出現在《知識分子》，是受邀評價韓春雨發表在《自然·生物技術》的工作。 「這篇文章比較聰明，還是走對了路，沒有研究如何使高溫才能工作的酶通過構象改變達到降溫，而是找到這樣一株可以在37度工作的Ago。」 5月7日深夜，魏文勝通過微信告訴《知識分子》。

　　魏文勝主要從事基因組編輯技術的發展與應用研究。他的課題組也曾試圖從Ago家族尋找合適的同源蛋白。隨後，魏文勝邀請韓春雨到北京大學生命科學學院做報告，並親自主持了5月27日的這場報告。

　　8月1日，《知識分子》再次聯繫魏文勝。他告訴我們，從5月上旬開始，他的實驗室多次根據韓春雨論文中的實驗方法在不同的細胞中做基因編輯的測試，「開始想的是效率很低，但還是工作的，結果我們到最後測序了一下發現完全沒有編輯」。

　　10月10日晚上，包括魏文勝、王皓毅和楊輝在內的12位科學家（后哈爾濱工業大學教授黃志偉加入，變為13名）通過《中青在線》和澎湃新聞實名發聲，宣布他們未能重複或再現韓春雨論文中的實驗結果，呼籲有關機構組織第三方介入調查。

　　六

　　今年5月第一次看到韓春雨等人的論文時，約翰·范德歐斯特（John van der Oost）感到既驚訝又激動。

　　荷蘭瓦赫寧恩大學（Wageningen University）的微生物學家范德歐斯特是世界範圍內最早開始研究CRISPR領域的科學家之一，與麻省理工學院博德研究所的張鋒和加州大學伯克利分校詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）均有過合作。2014年，范德歐斯特與合作者首先報道了嗜熱細菌T.thermophilus的Ago（TtAgo）具有在5』端磷酸化短單鏈DNA片段引導下切割靶DNA的能力；2015年，他的實驗室又報道嗜熱古菌P.furiosus的Ago（PfAgo）也具有類似的能力。不過，這些Ago的來源都是嗜熱菌，這決定了它們只能在高溫環境下（65攝氏度以上）進行反應，而無法應用到哺乳動物的細胞系統。

　　韓春雨團隊有關NgAgo的發現也正是建立在范德歐斯特小組2014年工作的基礎之上。

　　「我們對他們發表的切割活性感到很驚訝，因為這與我們以前觀測到的其它細菌中的Argonaute（簡稱Ago）蛋白的活性並不同。」8月1日，在給《知識分子》的回復中，范德歐斯特說，他的實驗室正在嘗試利用NgAgo進行基因編輯，但還沒有結果。

　　9月9日，范德歐斯特在給《知識分子》的回復中說，「我們將在下一周得到更多結果。」

　　10月6日，當《知識分子》進一步詢問范德歐斯特關於NgAgo的實驗進展時，他說：到目前為止，我們無法再現NgAgo蛋白的活性。在第二天的回復中，他補充說，他的實驗室還沒有放棄NgAgo，仍然在試圖利用NgAgo在體外切割（DNA）片段和質粒，但是，「到目前為止，我們無法重複刊發的數據」。

　　「一開始，我對論文感到非常激動，現在我有些懷疑。如果韓教授能夠置評一下就好了。」范德歐斯特說。

　　七

　　國內一位要求匿名的生物學家今年6月開始嘗試利用NgAgo編輯幾種哺乳動物細胞系基因組中的基因。

　　在經歷過幾個細胞繫上的失敗后，「我們觀察到針對綠色熒光GFP基因的NgAgo處理的人iPS細胞（基因組內有預先嵌入的綠色熒光GFP基因）有一些細胞綠色熒光降下來了。這個結果不奇怪，因為很多組發現Ngago系統有敲低現象，而沒有基因組編輯」。

　　經過深度測序，他發現Indels有存在，但是效率比Cas9低數倍，「而且發生的位置也很奇特」。 「第一，同組相應位點有Cas9的正對照，而且負對照組沒有Indel出現，雖然可能性不大但是從科學嚴謹的角度，我們仍然擔心可能存在Cas9系統污染到Ngago組的情況；第二，我們也擔心我們當時的生物信息學的分析方法不夠好，原因是我們第一輪擴增的時候，沒有用帶Barcode（單分子標籤，指一種在測序文庫建立過程中加入的DNA序列，用於在後續分析中唯一確定測序模板的來源）的引物，所以我們不能確定每個拷貝攜帶Indel的序列從哪裡來」。

　　10月10日，這位科學家告訴《知識分子》，正是因為實驗上的這些疑點讓他目前不能給出任何確切結論。

　　「我們剛開始的想法很簡單，在iPS細胞里做點編輯，驗證這個Ngago系統是否和Cas9一樣，就結束這個項目」。沒想到的是，在與同行的交流中，他得知有大量的實驗室無法重複出韓春雨論文實驗的結果。

　　目前，這位生物學家的實驗室正在進行新的一輪測試，「將採用更嚴格的測序方式，希望這次基本能夠告訴我們上一次看到的是不是真的」。

　　「最開始做這個是希望中國原創的東西真的好用，到現在這個程度，基本上就變成了我們出於想知道這個事情到底是怎麼回事，心理上有個交代。這是現在唯一的motivation（動力），畢竟也耗費不少時間和精力。」他說。

　　八

　　對於NgAgo可重複性的爭議，國際學術期刊《細胞研究》（Cell Research）常務副主編李黨生博士8月1日向《知識分子》表示，鑒於這篇論文及其所報道成果的受關注程度，論文的作者應尊重試圖重複過這個實驗的科學家們提出的疑問，儘可能幫助科學共同體消除疑問。

　　李黨生介紹了國際期刊對於爭議性研究的一般處理模式。

　　一是如果論文確實存在嚴重問題，通常原作者會主動澄清錯誤，要求撤稿。

　　還有就是其他人挑戰原研究的主要結果，一般是以類似於「論文」的形式把挑戰的文章提交到原論文發表的期刊。這類的挑戰文章若通過了同行評議並得到發表，期刊也會邀請原論文的作者給出書面回應；通常原論文作者的回應會和挑戰文章一起刊出。

　　如果原論文的作者不想回應，期刊則單獨刊發挑戰的文章。無論回應與否， 這類挑戰文章的刊出會提醒科學共同體注意相關研究結果或結論存在爭議的事實。

　　李黨生說，科學上的爭議的最終解決只能靠科學共同體的進一步驗證。

　　李黨生同時也表達了自己對於科學報道的看法。他認為，無論是肯定一個研究還是否定一個研究，都要小心審慎。

　　「一個新的研究成果剛發表出來，在未經進一步驗證前就被肯定到了吹捧的地步，是科學不成熟的表現。」李黨生說。

　　他強調，報道新的研究，尤其是一個高度吸睛的研究成果，一定要審慎，因為所有的科學結果發表出來以後，都需要科學界的進一步驗證。反之亦然，如果沒有確鑿的證據，僅通過媒體來質疑甚或「審判」一個經過同行評議的研究，「對原論文的作者來說恐怕也不見得公平」。

　　「一個新的研究成果做出來，科學家和公眾有批評的自由」，但是科學上的問題最後還是要由科學共同體來解決，而不是由媒體來評判，李黨生強調說。

　　10月12日，魏文勝告訴《知識分子》，包括他在內的多名科學家已經在匯總各自實驗室測試NgAgo的實驗數據，將在近期向《自然·生物技術》提交聯署文章，反映無法重複或再現韓春雨實驗結果的情況。

　　一位來自北京某高校實驗室的負責人也向《知識分子》介紹了其實驗室在斑馬魚受精卵和細胞上嘗試NgAgo失敗的過程，但是他希望能夠通過《自然·生物技術》直接交流，而不是通過媒體報道的方式解決這一爭議。

　　九

　　10月14日，河北科技大學通過河北新聞發布了一份「關於輿論質疑韓春雨成果情況的回應」，聲稱「已經有獨立於我校之外的機構運用韓春雨團隊的NgAgo技術實現了基因編輯」，並「懇請社會各界提供和諧寬鬆的輿論環境和文化氛圍，給予他們多一點支持、多一點時間、多一點耐心」。

　　一位要求匿名的科學家告訴《知識分子》，對於韓春雨論文的可重複性爭議，一個實驗室或幾個實驗做出來或做不出來，都不能直接證明韓春雨的實驗結果是否可重複。

　　「一定要由第三方公正地去做檢驗」，他認為，韓春雨所在機構河北科技大學或經費資助方自然基金委都可以組織第三方進行調查，「一定要在第三方公正客觀的監督之下，讓所有人都信服」。

　　然而，國家自然基金委很可能不是韓春雨實驗的直接資助方。根據10月15日的《鳳凰資訊》的報道，韓春雨論文的合作者、浙江大學研究員沈嘯首次公開回應爭議稱，「按學術常規論文的所有作者都必須在論文的『致謝』部分標明自己的基金來源。我標註了我的基金，韓春雨沒有基金。但這個研究基本上是韓春雨通過各個渠道自籌的，我的資金沒有投入實驗部分。」

　　10月13日，在接受《科技日報》採訪時，中科院微生物所研究員、中科院院士高福說，眾多科學家反映自己無法重複韓春雨論文中的實驗，「韓春雨有義務、有責任幫助大家完成實驗，包括公開他掌握的數據和實驗過程。」他同時向《科技日報》表示，「河北科技大學和相關部門必須站出來展開調查。不論是韓國的黃禹錫事件，還是日本的小保方晴子事件，最終都是他們所在的學校和科研單位進行的調查，並公布調查結果。」

　　截至目前，這一場巨大的學術爭議事件的調查何時到來，如何進行，甚至是否會開始，各方仍莫衷一是，考驗著科學共同體的神經。唯一可以確認的是，任由爭議無序發酵下去，顯然將有損科學的嚴肅，不利於中國科學生態的健康發展。（陳曉雪、李曉明）