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解析韓春雨新版實驗方法,其中增加了什麼內容?

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瘋瘋顛顛 發表於 2016-8-9 22:35 | 顯示全部樓層 |閱讀模式
 原創2016-08-09科研圈科研圈

  2016年8月8日,韓春雨向非盈利性質粒共享信息庫 Addgene 提交了其 NgAgo 技術的新版詳細實驗方法。同時,一項已有近200名科研人員參與的在線調查顯示,目前有 9 人聲稱在實驗中觀察到 NgAgo 的基因編輯效果。科研圈對比分析了韓春雨新公開的實驗細節,並對相關事件進行簡要解讀。

  整理   趙維傑 張帥琰 吳蘭

  三個月前,河北科技大學副教授韓春雨在《自然-生物技術》上發表了 NgAgo 酶對哺乳動物進行基因編輯的論文(F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016)。文章介紹了一種新型的基因編輯方法,迅速引起廣泛關注。

  然而,隨著時間推移,研究的可重複性問題為韓春雨團隊招致諸多質疑。8月2日,《自然-生物技術》宣布將按照既定流程對研究進行調查。8月8日,韓春雨向質粒共享信息庫 Addgene 提交新版的詳細實驗方法,其中補充了數項應特別注意的問題。

  (新版實驗方法全文,可至 https://www.addgene.org/static/d ... t_OG34WIqLRecj.docx 下載)。

  新版實驗方法具體分為細胞培養、質粒/gDNA 共轉染,以及基因組提取三個部分。對比《自然-生物技術》上 NgAgo 論文 Supplementary Information 中描述的 methods(詳見 http://www.nature.com/nbt/journa ... mentary-information),新實驗步驟有幾處改變:

  1   血清品牌由 Hyclone 變更為 Gibco 。

  2   增加了關於「293T 細胞貼壁不牢,換液時要小心操作」的小提示。

  3   建議在質粒/gDNA共轉染的8小時、12小時或24小時后,補轉一次 gDNA;舊版方法中只提及了「24小時」。

  4   舊版方法中,溶解和稀釋質粒及 gDNA 的緩衝液為含有 EDTA 的0.5xTE(5 mM Tris-HCl,  0.5 mM EDTA,  pH 8.0),而新方法中則變更為水(pH 8.0)。

  最後一處緩衝液配方的改變尤其引人注意——在韓春雨補充在實驗步驟之後的四條注意事項中,EDTA 再次出現:其中一條注意事項專門提到,應該避免向 NgAgo/gDNA 系統中加入 EDTA。這四條注意事項分別是:

  1   NgAgo/gDNA 系統對細胞中胞內菌和支原體感染敏感,在實驗前要仔細確認所使用的細胞株未被污染或污染已被徹底清除。

  2  由於 NgAgo/gDNA 系統需要鎂離子,在細胞消化和培養過程中要避免使用金屬離子螯合劑 EDTA。也可以在培養基中額外加入 5 mM或其他濃度的鎂離子。

  3  轉染試劑 Lipofectamine® 3000會阻礙 gDNA 進入細胞,不能用於轉染。可以使用轉染試劑 Lipofectamine® 2000。其他轉染試劑是否可用還有待驗證。

  4 建議使用 T4 PNK (Biolab) 對 gDNA 進行5』端磷酸化處理,處理體系如下:(體系略)處理后的 gDNA 無需再次純化,直接用水(pH 8.0)稀釋至300 μl,終濃度10 nM。

  據 Nature 報道,韓春雨近來每天都會收到很多騷擾電話和簡訊,但他始終堅信自己的研究成果沒有問題。Nature 將喜愛茶葉、古琴,並且從未出國的韓春雨稱為「隱士」,而今這位隱士不得不走上風口浪尖,直面質疑。 據新華網消息,河北科技大學將要求韓春雨在一個月內重複實驗,並邀第三方證實。

  為什麼 NgAgo 會「不好使」?

  NgAgo 之所以引起廣泛關注,在於其作為基因編輯工具顯現出的一些令人激動的新特性,賦予了其可觀的應用潛力。例如,NgAgo 系統沒有 PAM 序列依賴性,與 CRISPR 系統只能識別附近有 PAM 序列的靶點相比,NgAgo 理論上可切割的序列更多。其次,NgAgo 系統用以識別靶基因的先導物為 DNA(gDNA),與 CRISPR 使用的 gRNA 相比,易用性更強,成本更低。另外,NgAgo 系統可以作用於很難被 CRISPR 切割的 GC 富集區域。

  與此同時,NgAgo 系統也表現出一些劣勢。NgAgo 系統使用 5』 端磷酸化 gDNA ,這種先導物無法從質粒里表達獲得,不能在靶細胞里產生,只能在細胞外合成后輸入細胞內;研究者在執行基因編輯時,可能還需要持續向細胞內補充 gDNA。並且,gDNA 只能與新生的未成熟 NgAgo 蛋白結合形成複合物。

  愛丁堡大學 MRC 再生醫學中心的博士后 Pooran Dewari 專門研究基因編輯系統的優化,他表示,NgAgo 系統的目前的可重複性難題,無疑說明了這一系統的優化工作非常困難;他同時認為,NgAgo 系統難以優化的原因,可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳細胞中不能穩定持續存在,以及 NgAgo 蛋白無法在成熟狀態下與 gDNA 形成複合物。

  已有9人聲稱 NgAgo 有效

  自韓春雨2016年3月在線發表論文後,來自全世界的科研人員共發出將近400次獲取 NgAgo 質粒的請求。Pooran Dewari 面向正在重複 NgAgo 的科研人員發起了一項調查。調查發現,截至2016年8月8日,193名被調者中,各有9人聲稱在應用 NgAgo 系統后觀察到了基因剪切或插入跡象(indels and knock-in),100人聲稱無法觀察到剪切,47人聲稱無法觀察到基因插入。

  

  

  (調查全部內容見鏈接 :

  http://blog.addgene.org/google-f ... mpressions-of-ngago,不過需要翻牆;後台回復 NgAgo,可獲取調查最新結果完整截圖)

  然而,調查還顯示,大部分被調者仍未對 NgAgo 喪失耐心,其中66%的被調者表示會等待他人對這一系統的優化結果,10%的被調者表示會自己優化 NgAgo,24%的人表示將繼續使用 CRISPR。

  

  

  附:NgAgo 可重複性問題事件節點

  · 2016年6月,網路上逐步有傳言稱,國內外有多家實驗室重複不出韓春雨論文的實驗結果,引起部分科學家的質疑。韓春雨在回復中表示,新系統剛出來都會「不好使」,他也認同目前 NgAgo 系統不夠穩定,等2.0版本出來會找專門機構免費發放。

  · 7月2日,方舟子公開質疑該實驗的可重複性,NgAgo 研究可重複性問題自此規模化發酵,韓春雨也立刻進行了實驗方法上的回應,稱實驗重複失敗可能是由於支原體污染、試劑保存等問題。

  · 7月28日,先前聲稱 NgAgo 有效的澳大利亞遺傳學家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示,經進一步檢測,該技術無法進行基因編輯。他表示,NgAgo 也許會奏效,但鑒於其不穩定性,它並沒有 CRISPR 實用。

  · 7月29日,西班牙遺傳學家 Lluís Montoliu 向國際轉基因技術協會 (ISTT) 的同僚群發郵件,建議「放棄所有NgAgo相關項目」。與此同時,之前聲稱 NgAgo 有效的印度分子生物學家 Debojyoti Chakraborty 及德國癌症研究中心的遺傳學博士生 Jan Winter 也都表示先前結論有誤;Jan Winter 同時表示,自己並不認可韓春雨此前做出的回應。

  · 截至8月8日,愛丁堡大學 MRC 再生醫學中心的博士后 Pooran Dewari 發起的一項針對 NgAgo 研究可重複性的線上調研已經收到近 200 位研究者的回復,其中各有9人聲稱在應用 NgAgo 系統后觀察到了基因剪切或插入跡象(indels and knock-in),100人聲稱無法觀察到剪切,47人聲稱無法觀察到基因插入。

  · 據新華網消息,河北科技大學將要求韓春雨在一個月內重複實驗,並邀第三方證實。

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