有沒有生物醫學方面做小白鼠灌流實驗的高手？

    最近，想做小白鼠灌流實驗，自己經驗不多，希望高手指點。以下信息來自網路，看看有沒有問題。先謝謝了。

1，離體心臟灌注實驗（langendorff experiment）：在摘取麻醉的動物活體心臟之後用固定液灌流心臟。

（1）需要足夠細的主動脈插管，可以購買灌流針，也可以利用200ul的槍頭自己燒制，最好能使尖端帶有凹槽以利於系線固定（槍頭有凹槽），頭皮針太滑、太尖。

（2）足夠快的解剖操作，準確地將主動脈灌流針（或自製插管）插到主動脈（aorta，artery）根部，而不刺破主動脈瓣（aortic vaives）。

（3）減少插管前心臟的代謝，但是用冰水容易使主動脈回縮。

（4）灌流針從左心間插入，一般深度到達左動脈弓（aortic arch，arterial arcades）為宜，此時隱約能明顯看到針尖在動脈弓的位置。

（5）為了方便固定，可以用小號止血鉗夾住進針的位置，打開灌流器（蠕動泵之類），調節流速（這個值一般靠經驗），開始灌注。

        2，活體灌注固定實驗（perfusion-fixed experiment）：就是在麻醉的動物活體時通過心臟將4％的多聚甲醛（PFA）固定液灌流到全身。

（1）小鼠麻醉后，用大頭針固定四肢在泡沫板上。灌流器要事先準備好。

（2）剪開胸腔暴露心臟，用20ml注射器（尖端用血管鉗弄鈍，避免刺破心臟或主動脈）從心尖（apex）插入至升主動脈（ascending aorta，發自左心室，位於肺動脈干與上腔靜脈之間，向右前上方至右側第2胸肋關節後方移行為主動脈弓，升主動脈根部發出左、右冠狀動脈），用血管鉗固定針尖，也可以用鑷子固定針頭。注意：針頭不要扎得太深，進入左心室就可以了，不用非得進入主動脈，太深的話，扎破了室間隔進入肺循環后，肺就很快白了。

（3）用生理鹽水（normal saline，用於兩棲類動物時是0.67～0.70％，用於哺乳類動物和人體時是0.85～0.9％，人們平常點滴用的氯化鈉注射液濃度是0.9％）或者pbs快速先沖洗，

（4）待小鼠快變成「氣球小鼠」之前（其實很快，也就打開灌流器之後30秒不到），可以觀察灌流器工作阻力明顯增加，剪刀剪開右心包（也有剪右心耳的），讓灌流液流出。

（5）期間會觀察到的現象：四肢抽搐，鼠尾先翹起后僵直，肝臟顏色變淺，鼠口鼻中有白色泡沫湧出，腸道顏色稍有變化，但不是很明顯。

（6）用4％多聚甲醛緩慢沖洗灌注（也可以用注射器，但必須是技術相當熟練）。判斷灌注效果好不好的標誌是：鼠尾僵直；肝臟變成淺色，有的人直接描述為發白。

（6）灌流只是臨時固定，以便取較脆弱的組織（如脊髓和腦組織），取出來后的組織放到取材體積20倍的多聚甲醛溶液中固定。

（7）決定灌注質量的額外因素：小鼠麻醉劑量要合適，不能讓它麻醉過量；剪開胸腔前做好灌注準備，剪開之後立即操作。

（8）中心原則：一定要在灌流液進入之前，保證老鼠存活，血液循環暢通。

（9）如果要保留完好心臟，則可以繞過左心尖，直接從主動脈弓進針，可以直接將主動脈弓截斷，傷口進針，下口止血鉗封閉，灌注差不多時，就不用剪開右心包，直接打開下口。

（10）注射器灌注，由於壓力不好控制，容易導致小血管破裂，片子形態不好。

（11）鹽水一般30－50ml，PFA一般50mL左右，在換液時不要移動針頭。

    3，活體麻醉問題

       （1）1％戊巴比妥鈉，80mg/kg效果很好。

       （2）腹腔注射（IP）麻醉，藥物由腹腔粘膜吸收；如果誤打進了腸腔或膀胱就會導致效果不理想。

       （3）保證注入腹腔的辦法：拇指和食指捏住小鼠頭部皮膚，小鼠背靠手掌，將尾巴固定在小指和無名指縫中，此時小鼠牢固被固定在左手中。

       （4）看到小鼠的髂骨上緣了嗎？1mL的注射器沿髂骨上緣（大概是大腿前沿）水平進針，針尖的開口要向上（向外）；水平，是指沿小鼠的左右。進針后稍微搖動針尖，這樣即使針尖進入了腸腔，一搖自然就出來了。然後控制好量緩緩注射。

       （5）2％的戊巴比妥納效果也很好，劑量45mg/kg體重腹腔注射，約十分鐘達到最佳的麻醉狀態。

      （6）其它麻醉方法：氯胺酮（8 mg/ 100 g）；10％水合氯醛，3ml/kg；用麻醉機吸入麻醉劑（異氟醚）。

（收集編輯）

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