深度解讀2017年諾獎獲獎原因：生物鐘的分子研究

　　2017-10-02 18:37:17　來源: 知識分子

　　2017年諾貝爾生理學或醫學獎授予傑弗理·霍爾（Jeffrey C Hall）、邁克爾·羅斯巴希（Michael Rosbash）、邁克爾·楊（Michael W Young）。獲獎原因是「發現控制晝夜節律的分子機制」。

　　

　　生物的生命活動受內在生物節律調控

　　

　　人體在一天中的不同生理活動也受生物鐘調控

　　《知識分子》主編饒毅歷時4年撰寫兩萬字長文深度解讀生物鐘的分子研究歷史，在十一長假與各位讀者分享智力的愉悅。

　　勇氣和運氣：生物鐘的分子研究

　　撰文｜饒毅（《知識分子》主編、北京大學講席教授）

　　運氣，外在而縹緲；

　　勇氣，內生而實在。

　　運氣不會尋找勇氣；

　　勇氣可能碰到運氣。

　　在研究生物鐘基因的過程中，事先難以預料能否取得突破，事後分析發現勇氣足以成功，而運氣是錦上添花，雖然花開的特別燦爛。

　　生物鐘是生物體內周而復始的節律，如人們熟知的：動物的晝行夜伏、植物的春華秋實…。常見的近24小時晝夜節律（circadian rhythm）是典型的生物鐘之一。

　　生物鐘現象看似簡單，其實不盡然。人們熟知的向日葵朝向太陽，並非每天太陽先出來、向日葵後轉向，而是向日葵先朝向、而後才有太陽姍姍來遲。

　　生物鐘的本質難以入手，研究不容易。人們用電生理方法研究而不得入門，1971年從果蠅的一個基因出發開啟了生物鐘的基因研究，23年後才發現哺乳動物第一個生物鐘基因的突變，26年後明確哺乳類的生物鐘基因與果蠅的類似，30年後才發現同果蠅一樣的基因也控制人類生物鐘。

　　驅動生物鐘的內在機理隨著一個一個基因的發現和研究，逐漸明朗，從果蠅到人存在同樣一批控制生物鐘的基因，它們編碼的蛋白質合作共事，節律性地調節細胞內的基因轉錄，都採用了負反饋模式，並與光和溫度等外界因素協調，從而對應於地球自轉的近24小時節律。

　　研究生物鐘最重要的六位科學家都在美國，其中五位研究果蠅，一位研究小鼠。加州理工學院的Seymour Benzer（1921-2007）和Ronald Konopka（1947-2015）開創生物鐘的基因研究，發現第一個生物鐘基因period（per）。兩個團隊克隆per基因：洛克菲勒大學的Michael Young（1949-）領導的實驗室，Brandeis大學的Michael Rosbash（1944-）和Jeffrey Hall（1945-）兩個實驗室合作的團隊，他們都還發現調控生物鐘的更多基因。哺乳類生物鐘基因研究的突破來自當時在美國西北大學、現在西南醫學中心的Joseph S Takahashi（高橋,1951-）。

　　一百多年來，科學家們因研究果蠅而獲1933、1947、1995和2011年四次諾貝爾獎。如無意外，生物鐘的研究將讓果蠅再度引人矚目。

　　生物鐘的研究歷程，出現過有趣和尷尬的故事？

　　生物鐘的研究是否終結，沒有重大問題、只剩細節了？

　　生物鐘研究逾四十年，為何迄今尚未出現有效的應用成果？

　　行為研究的範式變化

　　生物鐘可以看成一種行為模式。

　　行為是可以被其他動物和人類研究者所觀察到的動物外在動作表現。行為研究的範式在1960年以前比較簡單，以描述性為主。

　　因研究消化系統而獲1904年諾獎的俄國科學家巴甫洛夫（Ivan Pavlov, 1849-1936），後來卻以條件反射的研究更為一般人所熟知。狗見到喜愛的食物會分泌唾液，而原本鈴聲不會誘導狗分泌唾液，但在鈴聲與食物多次同時出現后，單獨出現鈴聲可以誘導狗分泌唾液，說明聲音刺激與食物刺激之間可以建立聯繫。巴甫洛夫稱食物為無條件刺激，鈴聲為條件刺激，對條件刺激的反應為條件反射。這種簡單的行為學實驗是20世紀初行為學的重要進展。

　　行為學既與生理學和神經生物學相關，也與心理學很近。美國的行為主義開創者John B. Watson（1878-1958）於1913發表《行為學主義者宣言》，提出人和動物的行為都很簡單，由後天經歷所塑造。1920年他用11個月的男孩Albert做實驗，試圖說明只要後天刺激建立他的恐懼行為，把他本不怕的鼠與鐵棒聲音偶聯后，他見鼠和兔狗等其他動物都哭，認為這是條件反射塑造其行為。

　　美國著名心理學家B. F. Skinner（1904-1990）推廣行為主義，提出所有動物和人一樣，其行為都由後天刺激所塑造，是極端行為主義的代表。他發明了具體的實驗設計：操作性條件反射。巴甫洛夫的條件反射只看動物的反應、不看其動作。Skinner用鴿子做實驗，在鴿籠裝兩個鈕，鴿子碰一個鈕會得到吃的獎賞，觸另一鈕無獎。一段時間后，鴿子會經常去碰有獎鈕，這種條件反射可以由它主動的行為表現出來，而不是流唾液這種被動反應，稱為操作性條件反射，它迄今仍為研究學習記憶的重要模型。

　　1973年諾貝爾生理學或醫學獎授予研究行為的科學家：奧地利的Konrad Lorenz （1903-1989）和Karl von Frisch（1886-1982）、荷蘭的Nikolass Tinbergen（1907-1988）。他們的研究既不是生理學、更不是醫學，而是通過觀察動物行為作出推論，接近十九世紀的博物學。

　　von Frisch研究蜜蜂的行為，有多個發現如蜜蜂有內在的生物鐘、有超乎人類的識別偏振光的能力。他得獎是因為發現蜜蜂通過舞蹈傳送信息：一隻蜜蜂發現食物后，飛回蜂巢告訴其他蜜蜂食物所在地的遠近和角度、食物的多少。這是一個奇妙的社會行為，刺激科學界討論動物是否合作、能否交流、以及語言是什麼等問題。

　　Tinbergen的哥哥是1969年諾貝爾經濟獎得主。Tinbergen研究動物的本能行為。本能的行為是天生（並不一定是幼年表現的）、到一定時候動物會表現的行為，比如生殖行為無需教導、也無需觀察。Tinbergen和Lorenz發現動物有刻板動作，如一對鵝在交配后，公鵝要做一套特定動作；而一些刺激可以誘導特定動作，如有些特徵可刺激魚視之為敵而攻擊。Lorenz也做過本能實驗，但他更著名的研究是行為的印跡（imprinting）。他用灰腿鵝做實驗，在剛從蛋孵化后一段時期內，如果小鵝見到的移動物體只是Lorenz本人，那麼以後這些鵝視Lorenz為母親，他走到哪裡，它們跟到哪裡，甚至長大后碰見真鵝，它們猶豫再三還是跟著Lorenz本人。印跡只能在特定時期產生，稱為臨界期。

　　1951年Tinbergen提出研究行為有四個方面，兩個近端原因（proximate causes）：發育（行為如何在個體發育過程中形成），機理（個體行為的原理）。兩個終極原因（ultimate causes）：進化，和功能（如打架為了搶配偶或食物）。

　　行為的研究現在都還有很多停留在描述的程度。如2009年von Bayern等的論文，描述烏鴉如何被迫用小石頭幫助自己獲得嘴巴夠不著的食物。主要的行為學的教科書《動物行為學》超過這篇文章的內容也不多。

　　生物鐘研究的突破緣於遺傳學的應用。遺傳學從孟德爾經摩爾根到1960年代初主要研究的核心是遺傳的原理，揭示個體和群體的遺傳規律。而1960年代末開始，遺傳學作為重要的工具，提供研究生物現象的途徑。通過突變觀察到基因異常導致的表型，推論基因正常的功能，了解生物學機理。美國生物學家Leland Hartwell（1939-）研究酵母細胞分裂的遺傳突變，推論參與細胞分裂的基因，最後有助於理解人類的癌症。

　　通過異常現象了解正常規律，通過個別例外發現普適原理，是遺傳學的核心之一。

　　生物鐘的存在和意義

　　生物節律與其他節律一樣，有震蕩的幅度、周期、相位。

　　節律是生物鐘的外在表現，生物鐘是內在的定時機理。生物鐘本身是自我維持的生理和行為節律發生器（pacemaker），可以受外界環境因素（zeitgebers）所導引、從而同步化。

　　生物有多種節律，不同的生物有著不同的節律，同一生物也有多種節律。有些動物每年一個周期的冬眠、有些植物每年一個周期的長葉落葉，動物還有更快的周期如呼吸和心跳…，而人們熟知的節律是晝夜節律。不僅大家熟悉的睡眠有晝夜節律，很多其他行為和生理指標也有晝夜節律。

　

　公元4世紀，Androsthnenes知道羅望子樹樹葉的運動有晝夜差別（McClung, 2006）。義大利的Santorio Santorio（1561-1636）前後30年記錄自己從早到晚的攝食量、排泄量和體重變化，發現有晝夜規律。但他們未能區分外界影響的節律與生物自主的節律。1729年，法國天文學家Jacques Ortous de Mairan（1678-1771）用含羞草做材料，觀察其葉片和花的變化，將它放置在全暗處一段時間，葉片仍然有張有合，不依賴陽光，但他當時沒敢提出植物的晝夜節律是內在的（de Mairan， 1729；Szymanski，1918）。達爾文也研究過植物的節律，並提出晝夜節律的可遺傳性（Darwin and Darwin，1880）。常見的向日葵好像圍繞陽光的方向轉向，但通過紅外照相機可以看到向日葵朝向東方的行為早於日出，所以也是內在節律所驅動。晝夜節律並不依賴於地球自轉：放到太空，節律照常（Sulzman et al., 1984）。

　　Aschoff 和Wever （1976）總結人的晝夜節律，德國大學生待在二戰留下的堡壘中，燈光恆定、食物恆定、溫度恆定、聲音控制。在外界環境線索缺乏的情況下，人們仍然保持晝夜節律，只是在十幾天後相位滯后。

　　現在知道，從簡單的單細胞藍綠藻（cynobacteria）細菌到多細胞的人，很多生物有生物鐘的存在，但並不清楚是否所有地球上的生物都有晝夜節律。晝夜節律周期接近24小時（常見22至25小時）。在環境線索缺乏時可以繼續維持，節律的相位由最後一次環境線索（如光、或溫度等）所確定。在環境噪音中，節律照常運行。在一定範圍內，節律周期並不隨溫度的改變而劇烈改變，有溫度補償機制，這不同於一般生化反應：如溫度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。

　　晝夜節律的生物學意義目前仍不清楚。當然在進化過程中，生物活動與地球自轉相匹配，也許可以節省能量、或提高效率。但如果沒節律又會怎麼樣呢？藍綠藻有晝夜節律，把正常的藍綠藻與生物鐘周期異常的細菌在一起長期培養，發現最後生物鐘正常的細菌佔了絕大多數，由此可見生物鐘對生物體有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。擬南芥的研究也觀察到，周期縮短或延長的擬南芥，其固碳量、生長、存活都是與環境設定晝夜周期相吻合的擬南芥最適合，即：短周期突變株在20小時晝夜環境下生活得更好；而長周期突變株在28小時的模擬環境下更好（Dodd et al., 2005）。這些觀察，反映了只有當內外源周期保持一致時才最有利於植物生長。觀察到周期正常有利於植物，不等於能夠解釋為什麼，所以我們仍然是知其然、不知其所以然。

　　生物鐘研究的新途徑

　　怎麼研究生物鐘？

　　能看到動物、植物的變化，是外在表現，而不知道生物鐘的核心：振蕩發生器。

　　可以看到鐘的長針、短針運動的軌跡，不等於理解了指揮它們運動的機械裝置。

　　早期科學家用電生理研究生物鐘，插電極到細胞觀察電活動，曾觀察到腦內特定部位SCN（視交叉上核，suprachiasmatic nucleus）的電活動有晝夜周期。用解剖學研究，可以了解哪個器官、組織、部位對於個體的生物鐘至關重要。這一類研究中，在鳥類發現松果體很重要（Gaston and Menaker，1968；Zimmerman and Menaker，1979），而哺乳類動物的主鍾（master clock）被認為是SCN。確定主鐘的實驗有三類，以SCN為例：損毀它導致動物失去晝夜節律（Moore and Eichler，1972；Stephan and Zucker，1972）；將它加回損毀后的動物可恢復晝夜節律（Lehman et al., 1987）；在搗毀后，移植其他動物的SCN，新節律與移植物來源的動物節律一樣，例如，如果移植物來自周期22小時的動物，那麼接受移植的動物周期也是22小時，而如果移植物來自周期20小時的動物，接受移植的動物也獲得20小時的周期（Ralph et al., 1990）。

　　如果用遺傳學研究生物現象，特別是用前饋遺傳學（forward genetics）——隨機篩選影響特定生物現象的突變——無需假設機理；這有別於通常採用的轉特定基因、敲除特定基因的反向遺傳學（reverse genetics）。這是遺傳篩選的優點，但當時和現在都有人認為遺傳篩選有很大的缺點：很多行為恐怕不是單個或幾個基因所決定的，複雜的行為需要有很多基因參與，用遺傳篩選對單個和少數基因有效，對更多基因參與的行為可能效果很差。

　　對於果蠅的行為，Jerry Hirsch就認為不能用單基因解釋、也就不能通過遺傳篩選的方法研究行為，只能同時改變很多基因進行代間選擇來推斷。而本哲（Seymour Benzer，1921-2007）認為果蠅的行為可以用突變單個基因的前饋遺傳學來進行研究。1970年代，他們曾發生激烈爭論，Hirsch甚至給本哲所在加州理工學院的每一個教授寫信稱本哲的研究是偽科學。

　　本哲

　　紐約出生的波蘭猶太裔美國科學家本哲的大學是物理專業，1945年至1953年任教於普渡大學物理系，先研究過當時的熱門：鍺（Benzer, 1946）。1948年他開始通過參加暑期課程、訪問實驗室來學生物。1953年轉到生物系任教，研究分子生物學，有兩個很重要的工作：遺傳突變就是DNA鹼基序列的變化（Benzer, 1955）；基因的順反子定義（Benzer, 1959）。

　　

　　本哲與果蠅模型。圖片來源：wikipedia

　　在分子生物學做出諾貝爾程度的工作后，本哲與英國科學家、DNA雙螺旋共同發現者Francis Crick（1916-2004），南非猶太科學家、mRNA發現者Sydney Brenner（1927-）等認為，分子生物學的重要問題已解決、框架已建立，以後只有細節給後輩填空，而他們應該找下一個重要的領域。他們都選了神經生物學：Crick決定研究意識；Brenner決定需要新的模式生物研究神經生物學，他挑選了秀麗線蟲，開發了線蟲的遺傳學，帶出一批學生用線蟲研究了發育生物學和神經生物學,雖然失去了mRNA應該獲得的諾獎，但於2002年因為研究線蟲獲獎；本哲學習神經生物學后，決定用果蠅研究神經生物學。1967年，本哲轉到加州理工學院，並開始發表果蠅行為的遺傳學研究論文（Benzer，1967）。

　　本哲自1967年至2007年一直研究果蠅的行為。他轉而研究神經生物學的初期，不僅同事笑他（研究腦袋愚蠢的果蠅，是不是研究者腦袋有毛病），而且「聰明」的學生一般不樂意跟他（你已經功成名就，不怕掉進陷阱，我們可年輕賠不起，不能捨命陪君子）。這一幕在他和Brenner身上都發生過。早期他們的學生要麼不求功利、要麼不懂生物、要麼……總之大多都不是想安安穩穩的人。

　　結果，四十年中，本哲和他的學生們研究的很多方面都領先世界，包括學習記憶、性行為、離子通道、眼發育、人類神經退行性疾病的果蠅模型、痛等。他帶出的幾批學生和博士后成全世界神經生物學的重要一支。

　　本哲的分子生物學研究達到了諾獎程度，而他研究生物鐘也明顯達到諾獎程度。

　　偷懶是創新之母

　　1971年和1972年出現三篇文章，用遺傳學研究生物鐘。Konopka和Benzer（1971）發現影響果蠅生物鐘的突變、Feldman和Wasar（1971）發現影響真菌（粗糙麵包霉）生物鐘的突變、Bruce（1972）發現影響綠藻生物鐘的突變。突變是DNA序列的變化，位於特定基因內部、或者旁邊的DNA變化，可能影響基因的功能。有突變就有基因，這是那以前的遺傳學常識。

　　早在1935年就知道果蠅有生物節律。因為果蠅的研究者多，其研究工具多於真菌和綠藻。當然研究果蠅生物鐘的科學家前赴後繼也很重要。最終，果蠅的研究對生物鐘的理解起到的推動作用不僅多於真菌和綠藻，也多於其他任何生物。

　　

生物鐘的課題為當時還是研究生的Ronald Konopka（1947-2015）所提出（Rosbash，2015），在本哲用遺傳研究行為的總體框架之中。

　　

　　Ronald Konopka（1947-2015）

　　遺傳篩選的實驗設計是：建立檢測表型的方法，用致變劑誘導特定生物的不同基因發生突變，檢測不同突變種的表型。具體到果蠅的生物鐘，就應該是建立檢測生物鐘的方法，用化學誘變劑誘導不同基因突變，然後一隻一隻檢測果蠅，以便發現改變了晝夜節律的突變種。

　　當時沒人知道果蠅有約兩萬個基因，化學分子誘發隨機突變，只做兩萬隻果蠅不夠，其中部分突變在相同基因，所以應該加幾倍，才可能大部分基因都突變過一次。因行為有漂移，一個基因的突變種，不能僅檢測一隻果蠅，應該檢測幾隻到幾十隻。果蠅是二倍體，每個基因有兩套，一套壞了可以被另一個等位基因所代償，所以最好不要做子一代（F1）的篩選，而最好是F2代，傳代后再篩選，而F2代只有四分之一是同一基因突變的純合子那麼需要篩選的數量應一兩百萬，才算做過全基因組的篩選。

　　檢測果蠅晝夜節律的標準方法，是將單隻果蠅放到透明的管中，管子只容一隻果蠅來回走動。一束光射過小管的中央，凡是果蠅走過管中央，計算機就記錄果蠅運動了一次。以此檢測果蠅活動的變化，發現確實有晝夜規律。如檢測很多果蠅，工作量比較大。

　　Konopka和Benzer用了兩個偷工減料方法來加快速度。其一是果蠅遺傳學特有的attached X，可以快速檢測X染色體的突變。其二是他們決定不篩選晝夜節律，而篩另一節律：果蠅羽化。果蠅受精卵成為胚胎，發育成為幼蟲，三次蛻皮后成為蛹，蛹經過羽化成為成蟲。

　　晝夜活動節律是果蠅成蟲每天經歷一次、幾十天周而復始的循環。而果蠅一生僅羽化一次。羽化一般在黎明前，最遲也在上午。三十年代到五十年代的研究明確提出羽化為獨立於溫度的生物鐘所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物鐘與成蟲每天的活動生物鐘，是否有關，當時並不清楚。

　　Konopka覺得羽化作為篩選方法很容易操作。用單隻果蠅做經典的晝夜活動規律檢測比較慢。如果用羽化作為篩選方法，就很便當：化學誘變處理得到各種突變的果蠅猴，Konopka每天上午不來上班，午後到實驗室把所有羽化的果蠅倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影響節律的突變種，因為它們的羽化時間不同於正常（所謂「野生型」）果蠅。這樣的方法大大簡化了檢測、加速了篩選。

　　偷懶，依賴人腦的偷懶，（有時）是創新之母。

　　生物鐘研究的突破

　　對於一個研究生來說，用如此簡單的方法，不難篩選幾萬隻、幾十萬隻、幾百萬隻果蠅。但Konopka只篩選了不到兩百種品系的果蠅就得到第一個突變品系，繼續篩選不到兩千種品系的果蠅再得到兩個突變品系。

　　他們用羽化篩到突變品系后，更重要的是用標準檢測運動的晝夜節律之方法看個體的晝夜活動是否變化，結果發現確實突變果蠅的運動晝夜節律異常。有趣的是，他們發現的三種品系的突變果蠅在表型上並不相同：一種沒有節律，一種節律周期長短加快到19小時，一種節律變慢到28小時。他們進一步將突變種與已有的其他突變交配，確立三種突變在染色體圖譜的大概位置，結果發現很近，他們進一步把三種突變相互交配，進行本哲發明的順反檢測，試圖確立它們是否同一基因，他們根據得到的結果推測三種突變可能是同一個基因的不同突變。他們把這個基因命名為period（簡寫per），無節律的為per0（per zero）、節律短的為pers（per short）、節律長的為perl（per long）。這裡需要說明，他們進行的順反檢測並不嚴格，只做了反位（trans）的檢測沒做順位（cis）的檢測，所以只從1971年的文章不能完全斷定三個突變是否同一基因，雖然當時的結果支持這一可能。

　　他們篩選的果蠅數量不多，卻得到了一個基因的三種不同方向的突變，因此顯得特別有運氣。

　　各種篩選和檢測生物鐘的方法，都有可能在一些非生物鐘關鍵的基因導致的突變而有所影響。同一個基因可以出現三個方向的突變，不僅是運氣，而且對於這個基因的功能也提供了很好的支持：很難設想不參與驅動生物鐘的基因可以導致三個不同方向的突變表型。如果三個突變確為一個基因的三種突變，那麼per基因很可能是生物鐘的關鍵基因之一。

　　本哲於1940年代末期學生物的老師、1969年諾獎得主、德國物理學家轉為美國生物學家的Max Delbrück（1906-1981），這時也在加州理工學院，他聽本哲說結果后，並不信找到了生物鐘的基因：

　　Max Delbrück: 「I don』t believe it」

　　Benzer: 「But Max, we found the gene!」

　　Delbrück: 「I don』t believe a word of it.」

　　克隆per基因：競爭的好處

　　1971年，因為技術缺乏，不可能得到per基因的DNA（「克隆基因」）。重組DNA技術於1973年才發明，而克隆果蠅DNA的技術還要等到1978年在斯坦福大學的David Hogness和加州理工學院的Tom Maniatis等人的工作推動下才能進行。待所有技術都成熟以後才開始研究較容易，也容易成為跟風；不待技術成熟就開始研究是開拓，但有很大的危險，如果領先幾十年，可能開拓者一生也用不上。

　　1980年代是基因克隆的烽火連天時代。兩個團隊競爭克隆果蠅的per基因：洛克菲勒大學的Michael Young（楊邁克）；Brandeis大學的Jeffrey Hall（霍爾）與Michael Rosbash（羅斯巴希）。楊邁克是研究果蠅出身，博士后的老師為克隆果蠅DNA的先驅David Hogness。霍爾是本哲的博士后，懂果蠅，到Brandeis后與分子生物學專長的同事羅斯巴希合作。這些科學家都還有其他研究課題，楊邁克同時在與耶魯大學的希臘裔生物學家Spiros Artavanis-Tsakonas競爭克隆Notch基因，霍爾還在研究果蠅性行為的fruitless基因，羅斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接機理。

　　

　　左起分別為，邁克爾·楊（Michael W Young）、傑弗理·霍爾（Jeffrey C Hall）、邁克爾·羅斯巴希（Michael Rosbash），三人曾獲得2013年第十屆邵逸夫獎生命科學與醫學獎。

　　1984年，楊邁克和霍爾—羅斯巴希兩個團隊都拿到Per基因附近的基因組DNA（Bargiello and Young，1984；Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984）。這段DNA可以產生4.5kb和0.9kb兩種mRNA，所以可能對應兩個基因。霍爾—羅斯巴希組觀察到0.9kb之mRNA的含量有晝夜變化（Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984），認為相應的DNA為per基因。楊邁克認為4.5kb對應的基因是Per基因。後來兩個團隊都確認4.5kb對應的是per基因（Bargiello et al., 1984； Hamblen et al., 1986; Lorenz et al., 1989）。將編碼4.5kb mRNA的基因組DNA轉入果蠅，可以使per突變種果蠅的晝夜節律恢復正常。進一步發現改變導入的per基因表達的相位可改變果蠅晝夜節律的相位（Edery et al., 1994）。

　　在兩個團隊的競爭過程中，一個組出現錯誤（霍爾—羅斯巴希組最初錯認了per基因），被另外一個組糾正，這是競爭對科學界的好處。

　　兩組科學家都確定了per基因在最初三種突變株的DNA變化：per0、pers、perl分別是提前終止、和兩個不同部位的鹼基變化（Baylies et al., 1987; Yu et al., 1987a）。

　　霍爾—羅斯巴希組的中國留學生俞強還發現，缺失per蛋白質特定一段區域，晝夜活動節律不受影響，隻影響求偶時果蠅翅膀有節律的歌唱（Yu et al., 1987b）。霍爾實驗室在1980年發現果蠅求偶時的翅膀振蕩有節律（Kyriacou and Hall，1980），其後有爭議，近年有人正式提出商榷（Stern, 2014; Kyriacou et al., 2017; Stern et al., 2017）。

　　霍爾—羅斯巴希組早期參與生物鐘研究的中國留學生有：復旦大學本科畢業的俞強，北京醫學院的劉欣（Liu et al., 1988, 1992），復旦的黃佐石 （Huang et al., 1993），武漢大學的曾紅葵（Zeng et al., 1996）。

　　per的功能：競爭的壞處

　　拿到基因，令人鼓舞。

　　但是，拿到基因不一定就能夠立即知道機理。正如測序人類基因組只是工具，而不是美國總統等政治人物在一些羞恥感比較弱的科技工作者誘導下稱測序人類基因組就是揭示人類奧秘。今天對人類的奧秘還遠遠不清楚，單純測序本身也沒有自動解開人類奧秘。

　　同理，拿到了per基因的DNA，並不知道它所編碼產生的蛋白質的功能，也不能推導出生物鐘的機理。有時，拿到基因后很長時間都不能理解其功能，也就不能理解生物學過程或者人類疾病的機理。比如，萊－尼（Lesch-Nyhan）綜合征，病人自殘，是很特殊的疾病，其基因已經知道多年，編碼HGPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶），是核酸代謝的一個酶，但知道基因、知道蛋白質都不能告訴我們為什麼病人會自殘，也不能告訴我們有殘害他人能力的人們絕大多數都不會自殘的生理學原因。

　　要推出基因編碼蛋白質的功能，如果其預計的氨基酸序列與其他某種蛋白質有相似性，那麼功能就可能相似，從而可以提供研究的著手點。兩個組都看到per蛋白質有部分序列是重複的，楊邁克實驗室還以為它相似於小鼠的序列（Shin et al., 1985），後來發現並非如此。

　　1986年，兩個課題組都發表文章稱per蛋白質是蛋白多糖（Jackson et al., 1986; Reddy et al., 1986）。這次兩個課題組都錯了，競爭的課題組錯成一樣是咄咄怪事。

　　1987年，楊邁克課題組與愛因斯坦醫學院的David Spray實驗室合作，進一步發表文章（Bargiello et al., 1987），稱Per影響了細胞間交流（提示per可能起縫隙連接相關的功能，比如縫隙蛋白），這一結果很可能是從猜測per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——所以可能是縫隙蛋白的潛意識造成。但這一結果不能重複，1992年楊邁克和Spray合作團隊不得不道歉並收回1987年令人矚目的《自然》文章（Saez et al., 1992）。霍爾—羅斯巴希組於1993年也發表文章說明Per不參與細胞間連接（Flint et al., 1993）。

　　從1984至1987，在激烈競爭的過程中，兩個課題組都錯了兩次：各自分別錯了一次，同時錯了一次。同一項研究錯過兩次的比較少，出一樣的錯不免尷尬。

　　per mRNA的研究：仔細不是壞事

　　克隆獲得了基因，再看基因的表達是自然的延伸。

　　分子生物學的「中心法則」：DNA—RNA—蛋白質。DNA承載遺傳信息，可以複製和遺傳；在DNA指導下，遺傳信息轉錄為信使核糖核酸（mRNA）；在mRNA指導下合成蛋白質，蛋白質再起各種功能。不同基因轉錄產生不同mRNA、得到不同蛋白質，產生不同功能。

　　檢測基因表達可以檢測mRNA的表達，也可以檢測蛋白質的表達。一般來說，一個動物的大部分細胞含有同樣的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白質。霍爾—羅斯巴希組、楊邁克組都檢測per的mRNA和蛋白質表達在什麼時間和空間（James et al., 1986；Saez and Young, 1988；Liu et al., 1988；Siwicki et al., 1988；Zerr et al., 1990；Liu et al., 1992），其中費了很大的勁製造per蛋白質的抗體，因為mRNA只能抗基因表達的區域和細胞，幫助理解哪些區域和細胞可能是果蠅的生物鐘。但mRNA不能看到其產物蛋白質所在的亞細胞定位，而抗體可以識別蛋白質而確定per蛋白質在細胞內的位置。per蛋白質好像既可以存在於細胞核、也可以存在於細胞質（Saez and Young，1988；Siwicki et al., 1988）。到1992年，劉欣的文章才確認per蛋白質存在於細胞核（Liu et al., 1992）。

　　既然per基因參與晝夜節律，那麼per的基因表達（mRNA或者蛋白質）是否也有時間調控，例如晝夜差別？ 1988年，霍爾—羅斯巴希組提出per的蛋白質有晝夜變化（Siwicki et al., 1988）。per的mRNA是否有晝夜變化？理論上，研究RNA變化比研究蛋白質容易，因為不依賴於獲得好的抗體，而只要得到基因的DNA就很快可以通過普通的分子生物學方法研究mRNA的表達。但最初未見per的mRNA晝夜變化。一個可能是做實驗的人技術不好、或不仔細，一個可能是偶然的：傳說最初檢測per mRNA的人，是從果蠅全身獲得RNA，只分晝夜時間、不分身體部位。而出現突破的1990年，是從果蠅頭部提取RNA，避免其他部分（如腹部）所含RNA掩蓋了頭部mRNA。

　　為什麼需要專門研究頭裡的per基因?這與晝夜節律的關鍵部分存在於身體什麼部位有關。在得到per基因突變后，Handler和Konopka專門在不同突變型的果蠅之間進行局部細胞的移植，以便確定哪個部位起決定性作用。從pers果蠅取得腦組織，移植到per0果蠅腹腔中，發現per0變成了pers，顯示腦確定節律（Handler and Konopka，1979）。1983年，離開加州理工學院在Clarkson大學的Konopka等再用遺傳嵌合體做實驗，讓果蠅部分區域的細胞含突變的per（如pers），而其餘部分仍然正常，結果發現：如果腦含pers，果蠅的生物鐘就變短（Konopka et al., 1980）。所以，移植實驗和嵌合體實驗皆支持per基因在腦中控制全身的晝夜節律。

　　1990年，霍爾—羅斯巴希組的博士后Paul Hardin終於每個小時取果蠅的頭得到mRNA，再檢測per的mRNA，發現它呈晝夜變化（Hardin，Hall，Rosbash，1990）。在pers中，per的mRNA晝夜周期也縮短。他們提出簡單的模型：per的基因轉錄per的mRNA、翻譯產生per蛋白質的過程存在負反饋，per的mRNA或蛋白質產生后，可以影響per基因自身的轉錄。他們當時不能排除per調節晝夜節律這一行為之後，行為再通過更複雜的反饋作用於per基因轉錄。這裡需要用Occam剃刀原則，既首先檢測最簡單的可能性。這一簡單解釋提供了生物鐘機制的理論突破，是迄今為止仍被公認的「轉錄—翻譯負反饋環路（trans***ion-translation feedback loop, TTFL）」的基礎，羅斯巴希稱讚提出這一模型的博士后Hardin。

　　如果這一假設正確，那麼per蛋白質就是基因的轉錄調節因子。而對於轉錄因子，1980年代有很多進展，從而可以為研究per和生物鐘的機理提供很好的借鑒。

　　不久，霍爾—羅斯巴希組的Zerr又用抗體檢測提出per蛋白質的表達，在部分腦區也有晝夜節律，這種節律的長短也被per本身所調節，因為在生物鐘縮短的果蠅突變種pers中，per的蛋白質晝夜周期也縮短（Zerr et al., 1990）。mRNA的晝夜節律與蛋白質晝夜節律之間有一定的間隔，也就是相位不同。幾年之後知道不僅per蛋白質含量變化，而且其亞細胞定位變化：晝夜周期中，per蛋白質進入細胞核的時間有晝夜周期變化（Curtin et al., 1995）。

　　基因轉錄調控

　　1990年，研究果蠅生物鐘的Hardin等提出per蛋白質可能調節基因轉錄，依據的是間接證據。

　　1991年和1992年，其他途徑的研究發現了幾個與per有相似性區域的蛋白質。研究果蠅胚胎髮育的Crews實驗室發現一個基因single minded（sim），其缺失導致果蠅胚胎腹側中線的神經細胞缺乏（Nambu et al., 1990）。研究環境致癌物的Hoffman等和Burbach等，發現一個被致癌物二惡英(dioxin)作用的受體Ah R（Hoffman et al., 1991；Burbach, Poland, Bradfield, 1992）。per、Ah R和sim三個蛋白質都相似的區域稱為PAS區域。

　

　因為AhR確定是轉錄因子，而且有專門調節轉錄的區域bHLH，所以提示per和SIM也是轉錄調節因子，但per缺AhR具有的轉錄調節區域，只有PAS區域。1993年，羅斯巴希實驗室的黃佐石證明，PAS區域是蛋白質—蛋白質相互作用區域，PAS和PAS可以偶聚化（Huang, Edery and Rosbash，1993）。進一步研究提出，具有bHLH和PAS區域的蛋白質可能是轉錄激活因子，而只有PAS但缺乏bHLH的per蛋白質不能激活轉錄但可以抑制能夠激活轉錄而同時有bHLH和PAS區域的蛋白質（Lindebro, Poellinger and Whitelaw，1995）。

　　Hardin自己獨立實驗室后，證明per蛋白質調控per基因轉錄，依賴於per基因在蛋白質編碼區域之上游（分子生物學稱為5』端）的DNA序列（Hao, Allen and Hardin, 1997）。以後有更多證據表明，per參與轉錄調節，而且與多個基因有關。

　　更多參與果蠅生物鐘的基因

　　影響生物鐘不可能只有一個基因。

　　1971年發現第一個影響果蠅生物鐘的基因per。

　　1983年，Jackson發表了影響果蠅生物鐘的其他基因（Jackson，1983），但無果而終。

　　1990年，霍爾—羅斯巴希組發表「新」的果蠅晝夜節律基因「鍾」（Clock）（Dushay et al., 1990），不夠他們於1992年發現這不是新的基因而僅為per基因的另一突變而已（Dushay et al., 1992），辛勤努力化為一江春水。

　　1991年Konopka 等發表第二個影響果蠅生物鐘的基因Andante （Konopka, Smith and Orr，1991）。注意這一基因的人不多，到2003年它才被Tufts大學的Rob Jackson實驗室所克隆（Akten et al., 2003）。

　　1991年洛克菲勒大學楊邁克實驗室的Sehgal等在會議上報道她們篩選影響果蠅生物鐘的新基因（Sehgal et al., 1991）。

　　1994年，楊邁克實驗室報道他們發現了timeless基因（「無時間」，簡稱Tim），這次Seghal等通過篩選7千多個突變種找到第三個影響果蠅生物鐘的新基因（Seghal et al., 1994）。他們用了轉座子插入誘導突變，以利克隆基因，而最初的檢測也是羽化，其後用活動節律核實確實影響了晝夜節律。她們還發現tim的突變也影響per的RNA晝夜變化，所以與per基因相關。楊邁克實驗室的研究生Leslie Vosshall發現Tim影響Per蛋白質出入細胞核（Vosshall et al., 1994）。

　　楊邁克實驗室很快克隆到tim基因（Myers et al., 1995）。雖然預計的tim蛋白質序列看不出它是怎麼作用的蛋白質，但因為它可以結合per，那麼估計也是轉錄因子。羅斯巴希實驗室的研究生曾紅葵發現tim與per兩個蛋白質的相互作用有晝夜節律，而光可以調節tim蛋白質的穩定性，從而提供了光對生物鐘的調節的分子機理（Zeng et al., 1996）。

　　調節其他生物晝夜節律的基因

　　多種生物，從細菌、植物到包括人在內的動物，都有節律、有晝夜節律。存在於多種生物的生物鐘，是否用同樣的分子？是否用同樣的機理？

　　粗糙麵包霉（neurospora）的生物鐘基因Frequency （frq，「頻率」）於1989年被克隆，當時以為它與per有部分序列相似（McClung, Fox, Dunlap，1989），後來發現不相似。

　　控制有些細菌生物鐘的基因也紛紛被克隆（如，Liu et al., 1995）。

　　1995年，調節植物（如擬南芥）生物鐘的基因被克隆（Millar et al., 1995）。

　　很多人關心的是：哺乳類的生物鐘，用什麼基因？

　　千呼萬喚始出來：哺乳動物的生物鐘基因

　　調節哺乳動物生物鐘的第一個基因tau的突變種於1988年被偶然發現（Ralph and Menaker，1988），但基因克隆需要等到2000年（Lowrey et al., 2000），它編碼一個蛋白激酶（CKIε）。

　　在克隆了果蠅per基因的1984年至1997年，有很強烈的希望找到哺乳類生物鐘基因，明顯應找類似per的基因，但這一途徑費盡九牛二虎之力，並無顯著成果。曾找到了蠶的per基因（Reppert et al., 1994），但它無助於找哺乳類的per。

　　時代呼喚英雄，找到哺乳類生物鐘基因的英雄。

　　在美國芝加哥北郊西北大學工作的日裔科學家高橋決定不再依賴容易的方法，而用老鼠做遺傳篩選。

　　果蠅很小、生活周期短，方便且便宜。用要貴很多。如果通過篩選找基因，那麼除了如果蠅一樣算數量，還要考慮經費。為了在一定範圍省時間和經費，高橋實驗室不篩選純合體突變種，而篩雜合體。不過篩雜合體雖然省了工作量，但也降低了突變檢出率。即使這樣，也需要超過十萬隻的老鼠才能篩一遍。有個笑話：做這種實驗，類似把豪華旅館獻給老鼠。

　　1994年，可能世界上沒一個實驗室認為自己有足夠的經費。很可能用完了經費還找不到影響老鼠生物鐘的基因，所以沒人敢做。

　　高橋帶領實驗室是發憤圖強、還是鋌而走險?

　　他們的勇氣遇到了運氣。他們當時一共只研究了304隻小鼠，第25隻就是影響生物鐘的突變體，他們從而發現了影響老鼠生物鐘的基因，他們命名為「鍾」（Clock）（Vitaterna et al., 1994）。正常老鼠生物鐘的周期是23.7小時，Clock雜合的突變鼠晝夜節律為24.8，變化可謂微妙，需要可靠的檢測才能發現。從雜合體檢測出微小但可靠的變化后，高橋實驗室很容易通過交配小鼠而獲得Clock基因突變的純合體，其表型很強：完全喪失節律。

　　1997年，高橋實驗室在《細胞》雜誌發表兩篇論文，報道他們克隆的老鼠Clock基因（King et al., 1997；Antoch et el., 1997）。

　　老鼠Clock蛋白質不僅有與蛋白質相互作用的PAS區域，而且有直接結合DNA的bHLH區域（King et al., 1997），從而更容易理解它如何調節基因轉錄。Clock基因本身也表達於SCN。他們還發現人、雞、蜥蜴、蛙、魚也有Clock基因（King et al., 1997）。

　　果蠅與哺乳類是否有類似的分子機理?

　　如果果蠅的per基因只是在果蠅和昆蟲起作用，那麼意義就有限。如果找到高等動物的Per並因此開啟研究高等動物生物鐘的分子機理，那麼意義就較大。

　　果蠅的per基因在1984年被克隆后，長期有人（如麻省大學伍斯特校區的Steven Reppert）試圖在高等動物中找到Per基因，但無果。一般來說，一個基因在低等動物中發現后，在高等動物中比較容易找到，有多種方法可以通過DNA序列相似性找到。找不到有幾種可能：Per在高等動物不存在，例如果蠅的生物鐘可能高等動物的生物鐘不同，也可以是果蠅和高等動物生物鐘大體類似但其中有分子不同（如果蠅用per但高等動物不用）；另一可能是研究者技術上的問題，在高等動物存在Per基因，但未被找到。從1984年到1997年的努力都找不到哺乳動物的per基因的情況下，很多人灰心地認為恐怕哺乳類無Per。

　　1997年，兩個實驗室歪打正著，找到老鼠和人的Per （Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美國華人科學家在研究其他問題的時候，發現一個基因與per有序列相似性（Sun et al., 1997）。比較它們後知道，以前沒找到的原因是哺乳類的Per與果蠅的per基因在整個基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整體去找很難找到，而用局部的困難在當時並不知道哪段是保守的。

　　哺乳類的Per基因有三個 ：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表達在SCN（Shearman et al., 1997），其表達隨晝夜節律變化而變化，這一節律受Clock基因的調節（Jin et al., 1999）。

　　1998年，霍爾—羅斯巴希組通過遺傳篩選，也在果蠅找到Jrk基因，發現就是果蠅的clock基因（Allada et al., 1998）。有趣的是，Steve Kay實驗室發現clock蛋白可以激活帶有per基因啟動子片段E-box驅動的熒光素（luciferase）報告基因的表達，這一激活能被per自身所抑制，從而較好地實現負反饋環路的閉合（Darlington et al., 1998）。

　　首先在果蠅發現的per基因終於在哺乳類找到了，而首先在老鼠發現的基因Clock也在果蠅中發現了，從昆蟲到哺乳類，生物鐘的基因看來高度保守。這雖然是基因水平，但提示機理也保守。

　　從研究來說，鑽研果蠅生物鐘的科學家們就不用再擔心是自己怪癖，而確實可能是探討和揭示動物相通的普遍機理。

　　果蠅遺傳篩選對生物鐘研究的重要性

　　在生物鐘的基因研究過程中，果蠅一馬當先，科學家從中發現了per（Konopka and Benzer，1971）、andante （Konopka, Smith and Orr，1991）、tim（Sehgal et al., 1991, 1994）。

　　用果蠅研究生物鐘，在速度、價格、工作量上都優於哺乳類。用細菌、真菌、植物研究生物鐘，也可以有這些優勢，但它們的生物鐘基因與動物的不同，研究它們不能揭示哺乳類的生物鐘機理。

　　當然，在從各種生物得到答案之前，人們無法預料生物鐘的機理保守的範圍。但事後可以總結果蠅對於生物鐘研究的重要性。

　　並非所有低等生物的研究都適用於高等生物，有些相通、有些不同。例如：細胞周期的原理從酵母到人都保守，而性別確定的機理從果蠅到人類並不保守。雖然研究低等生物特有的生物學原理也有科學意義，但人偏於關注對高等生物適用的分子和規律。

　　在發現per、andante、tim等基因之後，科學家們還多次用果蠅繼續篩選影響生物鐘的基因。

　　霍爾實驗室建立用熒光素接在per基因位點，用酶活性間接報告per的轉錄情況（Brandes et al., 1996；Stanewsky et al., 1997； Plautz et al., 1997），篩選了5137株影響熒光素表達的果蠅突變種，發現chryptochrome （cry）基因參與果蠅生物鐘（Stanewsky et al., 1998）。用果蠅的遺傳研究發現cry的作用在於介導外界的光調節身體內在的生物鐘（Stanewsky et al., 1998）。生物鐘在沒有外界環境影響的情況下，可以自行運轉。在外界環境作用下，生物鐘與外界相配合。雖然其他如聲音、溫度、進食也可影響生物鐘，外界的光當然是調節生物鐘的關鍵因素之一。cry功能的發現解決了一個重要的問題。這裡也可以看到，遺傳篩選不僅為了找到基因，而且有時可能從基因編碼的蛋白質推測出分子機理，而了解機理是生物學基礎研究的核心。cry本身的mRNA表達也有晝夜節律，它也調節per和tim表達與光的關係（Emery et al., 1998；Stanewsky et al., 1998）。

　　果蠅有4套染色體。羅斯巴希—霍爾合作篩選第三號染色體，用化學誘變得到遺傳突變種，篩選了6千多種以後，發現jrk基因（Allada et al., 1998）。令人欣慰的是，果蠅的jrk原來就是小鼠Clock基因的同源基因。再找到的cycle基因，也有小鼠的類似基因Bmal（Rutila et al., 1998）。再度證實從昆蟲到哺乳類用同樣的基因調節生物鐘。

　　楊邁克實驗室在果蠅的第2和第3號染色體篩選了多於1萬5千種突變，發現了他們命名為doubletime的（「加時」）基因，而它編碼了酪蛋白激酶ε（CKIε）（Price et al., 1998）。它可以調節per蛋白質的穩定性。高橋實驗室於2000年克隆了金倉鼠的tau基因，發現原來也是CKIε（Lowrey et al., 2000）。開始研究蛋白激酶導致磷酸化、磷酸化調節蛋白質穩定性。

　　到2001年，已知多個基因在果蠅和小鼠都調節生物鐘：包括果蠅的一個per和小鼠的三個Per基因、果蠅的一個cry和小鼠的兩個Cry基因、果蠅的一個jrk/clock和小鼠的兩個Clock基因（Clock和Npas2）、果蠅的cycle和小鼠的Bmal1基因、果蠅的doubletime和小鼠的CKIδ和CKIε基因（Reppert and Weaver, 2001）。

　　篩選生物鐘相關基因的其他途徑

　　在完全不理解分子機理的情況下，用遺傳篩選生物鐘，是很強的方法。從分子上，稱之為「盲篩」，未嘗不可。盲篩的優點在於無需事先知道機理，而通過遺傳得到突變、DNA克隆得到分子、分子的序列特徵或更多研究，再揭示機理，或提供揭示機理的可能性。這是一些人所謂的「遺傳學的令人敬畏的力量」（the awesome power of genetics）。這一途徑被用於多個重要問題的研究，生物鐘是早期的研究對象之一，但非唯一。

　　在有其他線索時，在有其他突破點時，自然也無需假定遺傳學是唯一途徑。

　　在生物鐘研究中，當人們知道Per的mRNA表達有晝夜節律， Per蛋白質與Tim蛋白質有相互作用，蛋白激酶參與生物鐘，那麼可以通過這些特徵找其他基因（Abruzzi et al., 2017）。當技術發展，如分子生物學的RNAi（RNA干擾）技術等之後，也自然可以用新技術研究老問題。

　　事實上，早在1995年，哈佛醫學院Weitz實驗室的Gekakis等通過Per蛋白質尋找與Per直接相互作用的蛋白質，找到Tim蛋白質，發現Tim與Per兩個蛋白質直接結合（Gekakis et al., 1995）。他們用酵母雙雜交得到的這一發現與同期楊邁克實驗室用果蠅遺傳篩選的途徑異曲同工。而當時在美國聖地亞哥加州大學（UCSD）Steve Kay實驗室做博士后的張二荃首次用RNAi篩選生物鐘的基因，他利用當時已知多種細胞有生物鐘，而在體外培養的人類細胞用Per基因插入熒光素基因，通過熒光素基因的表達周期顯示生物鐘，張二荃因此找到影響人類生物鐘的基因（Zhang et al., 2009）。當然用活人是很難篩選基因的，但用體外培養的細胞就容易多了。

　　從1971年的果蠅篩選到2009年人的篩選，研究的時間跨度很大，但基因並沒有找全。果蠅的篩選就沒有篩完，而是每次都有局限，哺乳動物的篩選更沒有完。如果以後有更多、更好的途徑和方法，包括現有和已經用過但並未充分使用的方法，再發現影響生物鐘的基因，不會令人驚訝。

　　分子機理和細胞機理

　　發現基因固然重要。

　　但生物學基礎研究的目的是闡明機理。

　　綜合多年的研究結果，可以看到，Per調節基因轉錄，是分子機理的突破。簡而言之，Clock和Cycle蛋白質組成複合體，直接刺激一些下游靶基因的轉錄，這些靶基因進一步控制生物鐘。而Per和Tim蛋白複合體抑制Clock和Cycle的作用。Per基因和Tim基因本身還是Clock和Cycle的靶基因，從而組成轉錄反饋環。Per蛋白質的穩定性被磷酸化所調節，也就被doubletime或CK1δ和ε等蛋白激酶和去除磷酸化的蛋白磷酸酶所調節（Wijnen and Young，2006；Benito et al., 2007）。還有糖化修飾調節Per和Clock蛋白質。Cry介導光調節Tim/Per的穩定性。在Clock/Cycle和Per/Tim參與的主要轉錄環之外，還有其他轉錄環。還有其他基因如pdp1、vri、RORa和REV-ERBα參與轉錄調控。

　　Per和Tim蛋白質不僅有穩定性的問題，而且還有亞細胞定位問題：在細胞漿、還是細胞核。作為轉錄調節因子，它們只有在進入細胞核才能見到基因調節的機器，才能調節基因轉錄（Siepka et al., 2007；Dubowy and Sehgal，2017）。Per和Tim的mRNA在白天逐漸升高，到傍晚大大最高峰。兩個蛋白質的合成晚於其mRNA幾小時后逐漸積累，先在細胞漿，午夜進入細胞核。Tim蛋白質既在細胞漿內穩定Per蛋白質，也促進Per進入細胞核（Meyer, Saez and Young，2006）。

　　有趣的是，雖然細菌、真菌、和植物分別由其他分子組成生物鐘，核心都是振蕩器。這些生物的振蕩器由不同的分子組分，也是通過正反饋和負反饋來實現。外界的光或其它因素通過一定方式影響生物鐘的它們也用了轉錄調控、和磷酸化調節等（綜述見Wijnen and Young，2006）。而植物的生物鐘還用了細胞漿和細胞質定位的調節（Wang and Tobin，1998；Mas，2008）。因此，從細菌到人不同生物的生物鐘存在原理的共同性。

　　在細胞層面，目前認為，動物體內絕大多數細胞（甚至所有細胞）都有生物鐘（Emery et al., 1997；Giebultowicz and Hege，1997；Plautz et al., 1997）。果蠅的翅膀切下后依然可以觀察到其中的生物鐘影響，人的肝臟細胞體外培養也表現出代謝上的節律。現在認為生物鐘分為中樞的主鍾和外周的鐘。

　　在果蠅體內，推測大約150個表達Per和Tim基因的神經細胞組成主鍾（master clock），在哺乳類由SCN組成主鍾。小鼠的SCN含約兩萬個細胞，人的SCN約五萬細胞。外周鍾可以自行運轉，但主鍾控制全身的外周鍾，特別是同步化外周鍾。

　　Konopka和Benzer在1971年的文章就指出，突變基因起作用的解剖部位很重要。也就是說如果能夠找到這些細胞，就可能找到主生物鐘。一般推測果蠅腦含約25萬個神經細胞，而其中150個細胞是主生物鐘的推測是依據Per和Tim的功能和基因表達部位（Konopka and Benzer,1971；Vosshall and Young, 1995；Kaneko，Helfrich-Forster, Hall，1997；Panda，Hogenesch and Kay，2002；Helfrich-Forster, 2005）。它們包括：背側的神經元DN1、DN2、DN3，側后神經元LPNs，側面偏背神經元LNd、側面偏腹小神經元sLNvs、側面偏腹大神經元lLNvs。其中lLNvs神經元全部含PDF神經肽，而5個sLNvs中4個含PDF（Nitabach and Taghert，2008）。PDF在生物鐘也起重要作用（Renn et al., 1999）。這些細胞的功能也不一樣，含PDF的sLNvs細胞為控制果蠅早上活動的早晨細胞，而LNd和不含PDF的sLNvs細胞為控制果蠅傍晚活動的傍晚細胞。

　　哺乳動物的主鍾內部也有分工和協調。SCN的神經細胞分離的狀態下，分別有節律但不同步，而它們在一起時節律同步，有神經肽等分子參與，有神經網路。

　　人的生物鐘相關基因

　　雖然生物鐘對人很重要，而我們較晚理解人的生物鐘理解。遺傳和基因分析起了突破性的作用，並且與果蠅相似。

　　用8753對成年雙胞胎的研究表面，人的晝夜節律與很強的遺傳性（Koskenvuo et al., 2007）。

　

　　2001年，舊金山加州大學（UCSF）的Ptácek和Fu兩個合作實驗室發現，人的Per2基因（hPer2）與人的生物鐘相關。他們研究了一家遺傳性的相位變化。這家人的相位變快（家族性睡眠相位提前綜合征，FASPS），每天早上4點半醒，晚上7點半要睡，相位比一般人提前4小時。Ptácek和Fu對此家系的遺傳分析發現，他們中凡有hPer2編碼的特定位點（對應於其蛋白質序列的662位氨基酸）變化后，就患相位提前的病，凡是這個位點正常的人，就沒有相位提前病（Toh et al., 2001）。662位點相應的氨基酸是絲氨酸（簡稱S），他們當時以為S662是由CKIδ所磷酸化。2005年在Ptácek和Fu實驗室工作、現任教於蘇州大學的徐瓔發現CKIδ基因突變也能在人和小鼠導致相位提前（Xu et al., 2005）。

　　其後有更多基因被發現參與人的生物鐘（He et al., 2009）。楊邁克實驗室於2017年發現人的Cry1基因突變可以導致生物鐘相位推遲（晚睡晚起）（Patke et al., 2017）。

　　運氣和勇氣：孰輕孰重

　　生物鐘遺傳研究確實有運氣，但也有勇氣。

　　在看不清前途時默默探索，在一個小領域內長期耕耘；遇困難出差錯恐在所難免，碰運氣獲機遇也時有所得。

　　粗看似乎運氣重要，細看可見勇氣重要：勇於做前人沒做過、旁人沒想過、偉人不相信的工作。

　　Konopka和Benzer從兩千隻果蠅中篩到三隻突變果蠅，竟然是同一個基因的三個影響完全不一樣的突變。遺傳學研究的歷史上可能只有這一次小規模篩選中出現一個基因的三個功能改變的情況；生物學歷史上，這可能也是絕無僅有；說不定科學史上也是鳳毛麟角。如果沒有這樣的突變，可能還有些人會比較猶豫生物鐘能否用遺傳進行研究，因為可以設想一些在果蠅生物鐘篩選方法中有表型，但不一定反映生物鐘核心機構的基因。表型能否可靠並直接地幫助遺傳學家研究核心問題，是一個非常重要的問題。果蠅生物鐘的表型，幾十年後的今天看來非常可靠，但當初並不清楚。正如今天問：從果蠅檢測的睡眠，是否真是睡眠？很多人，包括研究果蠅的科學家，都不敢清晰地回答這一問題。

　　高橋實驗室在老鼠的篩選過程中，第25隻老鼠就是影響生物鐘的突變，也有很大的運氣。如果沒有這樣的運氣，就要花很多的時間，而且老鼠的研究很費錢，沒有足夠的人力物力就做不成。一般人預計到成本，就不能做這樣的研究。

　　現在我們可以事後諸葛亮，總結以後多個實驗而意識到：實際上只要做足夠的篩選，不是篩兩千隻果蠅，而是篩兩萬隻果蠅，基本一定能找到生物鐘的突變。雖然不會得到一個基因的三種不同方向的突變，但同樣會帶來突破的可能性。多次篩選果蠅生物鐘突變種的多次篩選，只有兩次比較倒霉，一次是重複發現以前的基因、一次搞錯了，其他都找到基因，而且是新的基因。

　　高橋實驗室用老鼠篩選生物鐘突變基因，也有運氣。但事後看來，如果有決心、經費夠，篩選超過幾千隻就應該能得到影響生物鐘的基因。而幾千隻老鼠的經費，並非只有高橋實驗室才有。對這一經驗的總結並非徒勞，原在美國西南醫學中心、現在日本筑波國際睡眠醫學研究所的Masashi Yanagisawa及其團隊，就用較大經費專門篩選小鼠睡眠的突變種，找到影響小鼠睡眠的基因（Funato et al., 2016）。

　　Konopka在研究過程中遇到了生物學空前絕後的運氣，但個人機遇卻相當不好。他畢業後到斯坦福大學做過短暫博士后，1974年回加州理工任助理教授，但評終身教授時未通過，主要原因是文章太少。他到Clarkson大學任教，因人事變動，再次未獲終身教授，1990年回到加州輔導高中生，2015年心臟病去世（Rosbash，2015）。

　　懸而未決的問題

　　今天，生物鐘的重要問題並未全部解決。

　　已經發現的參與生物鐘的基因，其機理並非完全清晰。例如，研究的最多、時間最長的是Per，但迄今並不十分清楚Per蛋白質如何調節基因轉錄。再如，Ptácek和Fu實驗室從2001到2005的研究表明hPer2在S662位點磷酸化很重要，並提出CKIδ是磷酸這一位點的蛋白激酶。但令人驚訝的是，徐瓔在他們實驗室於2007年發表進一步工作表明CKIδ蛋白激酶並不能磷酸化hPer2蛋白質的S662（Xu et al., 2007）。因此，自從2001年發現的對人的生物鐘至關重要的S662位點，居然迄今不知道其蛋白激酶。17年來，不同實驗室努力試過找識別磷酸化S662位點的抗體，以便簡單、快速檢測S662是否磷酸化，迄今無成功的報道。Per蛋白質有多個可以被磷酸化位點，它們確實在體內被磷酸化嗎？它們各有什麼功能意義？

　　了解參與生物鐘蛋白質，能否構建很好的數學模型，在定性的基礎上邁進定量的時代？

　　主鍾細胞內的基因恐怕沒有窮盡，而是還有。

　　主鐘的細胞間如何相互作用？只是神經細胞參與生物鐘，還是有神經膠質細胞參與（Tso et al., 2017）？環路如何構建？

　　中樞主鍾如何調節外周鍾？無論在果蠅還是哺乳類，都不能說十分清楚。果蠅這方面的一個研究論文被撤稿。而高橋實驗室提出小鼠的主鍾通過調節體溫而協調外周鍾，也不一定是普遍為人們所接受。

　　生物鐘與代謝、代謝疾病的關係及其機理（Turek et al., 2005；Lamia et al., 2008; Marcheva et al., 2010；Robles, Humphrey and Mann，2017）

　　本文討論的生物鐘，主要是近24小時的晝夜節律。還有非24小時的其他節律，它們的機理是什麼？

　　基礎研究之外，生物鐘的研究應該可以產出人類應用的成果，但生物鐘研究迄今沒拿出調節時差的藥物。現代社會對於調節時差有較大需求。各種值班導致英美近六分之一的上班族需要調時差，而且人類跨時區旅行量每年數以億計，老年人睡眠問題相當部分是生物鐘異常所致，所以調節時差對於工作效率和生活質量都很重要。大藥廠保守僵化，拘泥於已有領域（癌症、神經精神、抗感染…），對於時差不重視可能是原因之一。

　　理論上與生物鐘相關的問題中最重要的，是迄今理解不多的睡眠。理解生物鐘可以解釋睡眠的相位（何時睡），但不能解釋睡眠本身。睡眠的機理目前理解很少。教科書中睡眠的內容相當大部分是腦電圖的描繪，是現象的描述不是機理的理解。睡眠研究任重道遠。Orexin及其受體的研究曾認為是突破，但帶來的進展有限。而2016年柳沢正史（Masashi Yanagisawa）及其合作者發現的Sik3基因，是否是睡眠分子機理的關鍵突破，值得拭目以待。（完）

　　作者註：本文起源於授課，文字始於2014年10月6日，繼續於2015和2016年10月，第一稿完成於2017年10月1日，10月2日部分修改。

　　注1：果蠅的四次諾貝爾獎為1933年美國的摩爾根（豐富染色體遺傳學說和規律），1947年摩爾根的學生穆勒（發現X線誘導基因突變），1995年美國的路易斯、德國的鈕斯蘭-沃哈特、美國的維西豪斯（發育的基因），2011年法國的霍夫曼（先天免疫的基因）。

　　注2：希望依靠論文引用數來衡量工作的效果不高。生物鐘領域最高引用的文章不過一千三百多次，而同領域其他較好的文章一般引用幾百次。這樣的數字比一些熱門領域少很多。其實是說明少數人推動了重要的研究領域，而人數眾引用多的領域是因跟風者眾、並非做關鍵重要研究的人多。

　　注3：年度的節律為cirannual，晝夜（接近24小時）為circadian，短於24小時的為ultradian，長於24小時的為infradian。

　　注4：John Watson的研究有爭議，從一例先天智力障礙的患者得出結論能否推廣，另外再倫理問題用小孩做干涉性實驗如何消除對小孩的不良影響。

　　注5：本文省略了對Konopka和Benzer用attached X的部分。摩爾根的妻子Lilian Morgan本來是獨立的科學家，結婚後暫停工作十幾年，生兒育女后重返實驗室，只能在Morgan實驗室，她五十多歲發現的attached X果蠅，對於果蠅研究很有用處。Konopka和Benzer用了attached X，省了一代的交配，加快了篩選速度。

　　注6：雖然只有動物有視覺，但動物和植物（以及有些細菌）都有感光系統，而動物和植物分別用一些分子感光，但只有Cry蛋白質是動植物都用於感光的分子。這本來也是研究Cry是否參與晝夜節律的一個原因，但奇怪的是，後來的實驗表明參與晝夜節律的Cry並不能感光，現在Cry的作用機理不明。

　　致謝：感謝李曉明、張二荃、徐瓔、俞強、劉欣、羅冬根、梁希同的修改或反饋。