染色體的研究方法與研究進展（1）

前言
染色體是與遺傳信息從一個世代轉移到另一世代有關並依次釋放這些信息以控制細胞功能和發育的一組生物大分子。1831 年，英國人Robert Brown 發現植物細胞核；1848年，德國人W. Hofmeister從鴨跖草的小孢子母細胞中發現了細胞核內能被染色的絲狀體的存在；1865年奧地利科學家Gregor Mendel建立了遺傳學，他在植株（豌豆）雜交試驗基礎上總結出的二個著名遺傳學定律—分離定律和獨立分配定律中，並提出基因的概念；1869年，瑞士人F. Miescher 從膿細胞中分離出核酸；1888年，德國人H. von Waldeyer稱這種絲狀體為「染色體」（Chromosome），並猜測染色體與遺傳有關。據Waldeyer的解釋，染色體一詞在希臘語中的意思是「帶顏色的物體」。隨著生物學的發展，現代技術對染色體各方面的研究發現，這是一個早成的恰當的科學術語。1909年起，Morgan和他的學生以果蠅（Drosophila melanogaster）為材料研究生物遺傳規律，他們觀察到一種白眼突變體與性染色體的聯繫，在此基礎上於1910年首先提出基因定位於染色體上的論點。此後幾年中，他們又發現了多個伴性基因，並以此為據總結出了遺傳學上著名的基因連鎖和交換規律[1~3]。
染色體是生物細胞中的一個重要的組成部分，每一物種都有一定數目及一定形態結構，染色體能通過細胞分裂而複製，並且在世代相傳的過程中具有穩定地保持形態、結構和功能的特徵。染色體由DNA-蛋白質-RNA的混合物組成，在細胞周期的中期得到了最大限度的濃縮。染色體具有3個基本元素：自主複製序列（Autonomously replicating DNA sequence，ARS）、著絲粒序列（Centromere DNA sequence，CEN）、端粒序列（Telomere DNA sequence，TEL）。1983年，A. W. Murray等人首次成功構建了包括ARS、CEN、TEL和外源DNA，總長度為55kb的酵母人工染色體（Yeast Artificial Chromosome，YAC），分子生物學的研究進入了嶄新的時代。染色體的外形、成分以及行為等在發育過程中決不是不變的。物種在進化過程中所發生的遺傳物質的變化，常表現為染色體數目和結構的變化，這種變化無疑在物種形成中起著重要作用，也表現了生物在染色體水平豐富的多樣性[4]。

1        染色體的形態與結構（Modality and structure）
染色體物質存在於細胞核內，經適當染色后可見的由細絲狀顆粒物質所組成，只有當細胞分裂時在其前期未到中期才表現出典型的染色體形態。在不同物種的細胞中，它們的數目不一樣，但總是以二條成對的同源染色體的形式存在。根據染色體的形態，將染色體劃分為A染色體、B染色體、T染色體、W染色體、X染色體、Y染色體和Z染色體等，以及同源染色體、異源染色體、染色單體（Chromatid）、姐妹染色單體、多線染色體燈刷染色體、超數染色體和異染色體（Heterchromosome）等，其中，W、X、Y、Z等與性別相關的染色體稱為性染色體（Sex chromosome）。在染色體的不同部位上，由於染色質組成和分佈上的差異，分為常染色質區和異染色質區，二者在結構上是連續的，這種差別被稱為「異固縮現象（Heteropycnotic）」。其特徵為異染色質區的複製多遲於常染色質區，在遺傳上表現為惰性狀態，而常染色質區在遺傳功能上具有更為積極的作用。在形態上每條染色體被著絲粒分為長臂和短臂兩部分，根據染色體兩臂的長度可將染色體分為三類：一類是近端著絲粒染色體；其二是近中著絲粒染色體；第三為中間著絲粒染色體。在三類染色體中，近端著絲粒染色體的次縊痕末端由一條染色質絲連著一小段染色體稱為隨體。次縊痕類似於主縊痕（著絲粒）但該區不能彎曲，且多與核仁形成有關，又稱為核仁形成區。染色體的超微結構顯示染色體是由直徑達1000nm的DNA-組蛋白高度螺旋化的纖維所組成。每一條染色單體可看作一條雙螺旋的DNA分子。有絲分裂間期時，DNA解螺旋而形成無限伸展的細絲，此時不易為染料所著色，光鏡下呈無定形物質，稱之為染色質。有絲分裂時DNA高度螺旋化而呈現特定的形態，此時易為鹼性染料著色，稱之為染色體。
染色體結構變化包括：嵌合、融合、多態、配對、干擾、畸變、斷裂、突變等。染色體數目或結構異常所致的疾病稱為染色體病。現已查明人類染色體結構異常近4000種，染色體綜合症300餘種。在染色體的報告中，常可見到的結構異常還有等臂染色體（i）、斷裂（b）、斷片（f）、 裂隙（g）、雙微體（dmin）、雙著絲粒染色體（dic）、微小體（min）、內複製（end）、三射體（tr）、四射體（qr）、環狀染色體（r）、隨體（s）、標記染色體（mar）、衍生染色體（der）等。同種細胞內染色體的形態、大小、著絲粒及次縊痕在染色體上的位置以及隨體的有無都是相對固定的，均為染色體認別中的重要標誌[5~7]。

2        染色體的核型（Karyotype）
由於染色體的數目恆定，其在細胞核中的表現具有一定的種的特異性。染色體核型是指描述一個生物體內所有染色體的大小、形狀和數量信息的圖象。將成對的染色體按形狀、大小依順序排列起來叫核型圖，而染色體組型（Idiogram）通常指核型的模式圖，代表一個物種的模式特徵。這種組型技術可用來尋找染色體歧變同特定疾病的關係，比如：染色體數目的異常增加、形狀發生異常變化等。不但在很大程度上具有物種的特異性，而且反映了物種的分化和形成過程、親緣關係、演化途徑和演化歷史。由於染色體的二倍型在有性染色體的生物中除有減少不育的優點之外，還在於它有利於新複製基因座位的結構和調節功能分化，故大多生物的染色體也均為2n。各種生物的染色體數目都是相對恆定的，通常體細胞內的染色體數目比其生殖細胞中的染色體數目多一倍，分別用2n和n表示。性細胞染色體為單倍體（haploid），用n表示，體細胞為2倍體（diploid）以2n表示。
染色體的數目因物種而異，如人類2n=46，黑猩猩2n=48，果蠅2n=8，家蠶2n=56，小麥2n=42，水稻2n=24，洋蔥2n=16。在植物中染色體最少的是一種菊科植物Haplopapus gracillis 僅2對染色體，最多的是瓶爾草屬phioglossum的一些物種，可達400－600對。在動物中染色體最少的是一種介殼蟲的雄蟲steatococcus tuberculatus僅有兩條染色體，而另一極端是一種灰蝶有217－223對染色體。1956年美籍華人蔣有興等證明人類染色體數目為46條即2n=46、n=23。魚類的染色體數目變異很大，最少的是鮭形目（2n＝12）；最多的是鱘形目（2n＝264±）。大多數淡水魚類的染色體數目集中在2n＝44－52。在染色體的核型公式中，通常需要表示出一個物種全部染色體的中部著絲粒（m）、亞中部著絲粒（sm）、端部著絲粒（t）以及亞端部著絲粒（st）的染色體數量，如白緣魚央 的2n數在雌雄中都是24，在雄魚中染色體核型為19m＋2sm＋2st＋1t；而在雌魚中為20m＋2sm＋2st，差別就在於雄魚的一條染色體為端部著絲粒（即Y染色體），雄魚中有一條獨一無二的端部著絲點染色體，可在顯微鏡下直接識別出，雌魚中比雄性中多一條m組染色體，這樣雄性中就存在一對異形染色體，其性別決定為XX／XY[4,8]。
現代生物技術的發展可以通過染色體或基因組的改變而催化物種的形成，從而對種群和生物多樣性產生影響。染色體數目異常的主要原因在於生殖細胞分裂過程中出現了染色體的行為異常。如整倍體（染色體數目整倍的增減，常由雙雄受精、雙雌受精和核內複製造成）、非整倍體（由染色體不分離、染色體丟失所致）以及嵌合體（一個個體中存在著一個以上細胞系，在受精及受精卵的早期，受精或早期卵裂階段發生了異常受精或染色體不分離、染色體丟失及核內複製等可導致嵌合體發生）。將以上染色體組成不同於二倍體的細胞或個體統稱為異倍體。異倍體產生的機理主要與染色體不分離和內複製有關。染色體的結構異常包括缺失、重複、倒位和易位四種類型。染色體核型是生物標記的細胞學標記中主要標記技術之一。

3        染色體的帶型（Bands）
1970年顯帶技術問世標誌著細胞遺傳學進入了顯帶時期。有人稱顯帶技術的問世是細胞遺傳學進入了蜜月期，該技術的問世，帶來了遺傳學的飛速發展。顯帶是一類分帶技術，是一種經物理、化學因素處理后，再用染料對染色體進行分化染色，使其呈現特定的深淺不同或明暗不同的帶紋（band）的方法。對染色體的染色，許多特殊的染料將中期染色體（Metaphase chromosome）識別為均質的結構，而某些染色方法產生具有種屬特異性橫紋的差示染色帶，這些顯帶圖型在發育過程中以及不同組織的細胞間是恆定的。顯帶方法有的以染料為基礎，有的以功能為基礎。因此，染色體帶是染色質片段的展示，這些染色質片段具有相對均質性，但其功能和結構特點截然不同，每一片段均跨越足夠大的區域以便在光學上與鄰近的片段區分。
顯帶技術從染色體的顯帶多少可分為兩大類，一類是產生的染色帶分佈在整過染色體的長度上如：G（Gimsa，吉姆薩）帶、Q（quinacrine，喹吖因）帶和R（reverse，相反）帶等，另一類是局部性的顯帶，它只能使少數特定的區域顯帶，如C（centromere，著絲粒）帶、Cd（centromeric dots，著絲粒點）帶、T（telomere，端粒）帶和N（Ag-NOR，銀染）帶等。最常用的基於染料的染色體顯帶技術有：C帶、Q帶、G帶、R帶、T帶、N帶、SCE（sister chromatid exchange，姐妹染色單體互換）等。應用最廣的基於功能的染色體顯帶技術是複製顯帶技術。由於真核生物DNA的複製受到短暫控制，且在細胞周期的S期，不同染色體在不同的時間複製其DNA。R帶中的DNA複製通常早於G帶中的DNA。在減數分裂染色體上觀察到的染色粒圖型，也可以被認為是一種基於功能的染色體顯帶圖型。G帶對應於濃縮的減數分裂染色粒，而R帶對應於染色粒間區。染色體酶切顯帶（Chromosome restriction endonuclease digestion，CRED）是一種基於DNA序列差異的顯帶方法。染色體帶型也是生物標記的細胞學標記中主要標記技術之一[1~7]。

4        細胞分裂（Cell division）
A. Trembley（1710－1784）在18世紀40年代首次描述了原生動物的細胞分裂。1832年，德國人C. J. Dumortier 觀察了藻類的細胞分裂，並認為細胞來源於原來存在的細胞；1835年，德國人H. von Molh 仔細觀察了植物的細胞分裂，認為是植物的根和芽尖極易觀察到的現象；1841年，波蘭人R. Remak發現雞胚血細胞的直接分裂（無絲分裂，Amitosis）；1876年，德國人O.Hertwig發現海膽的受精（Fertilization）現象；1879年，德國人W. Flemming觀察了蠑螈細胞的有絲分裂，於1882年提出了有絲分裂（Mitosis）這一術語。後來德國人E. Strasburger在植物細胞中發現有絲分裂，認為有絲分裂的實質是核內絲狀物（染色體）的形成及其向兩個子細胞的平均分配，動植物的受精實質上是父本和母本配子核的融合，並於1984年提出了前期（Prophase）和中期（Metaphase）的概念；1883年，比利時人E. van Beneden 證明馬蛔蟲Ascaris megalocephala配子的染色體數目是體細胞的一半，並且在受精過程中卵子和精子貢獻給合子的染色體數目相等；1892年，德國人T. Boveri和O. Hertwig研究了減數分裂（Meiosis）的本質，並描述了染色體聯會現象；1908年，美國人T. H. Morgan以果蠅（Drosophila melanogaster）為材料開始著名的遺傳學實驗，1910年提出遺傳的染色體理論，1919年發表「遺傳的本質」（Physical Basis of Heredity）；1926年發表「基因學說」（The Theory of the Gene）。
當細胞分裂時它的核也同時分裂，而且後來被認為是細胞分裂最重要的方面。起初人們認為核僅僅充滿了顆粒狀物質，當細胞分裂時，等量地分配在子細胞的細胞核中（直接細胞分裂）。然而隨著光學部件質量的提高以及顯微技術的改進使細胞（及核）分裂的每個階段都能更精確地加以研究。在有絲分裂的某些階段，細胞核似乎被絲、線、帶充滿。由於顯微鏡技術的進步，得以證實細胞核（及其染色物質）在連續的細胞分裂之間並不溶解，在靜止期也以不同的形式保存著。此外，這種技術進步使得人們對有絲分裂的三個主要（以及一些次要的）階段（分期）可以進行準確的描述；這三個階段後來被依次稱為前期、中期、後期。細胞分裂的研究促進了染色體的結構與功能的研究，並對遺傳與變異、醫學遺傳疾病、農業遺傳育種以及物種多樣性等的研究產生了巨大影響[1~7]。

5        染色體的DNA
染色體的化學成分是DNA、RNA和蛋白質組成的核蛋白物質。DNA是染色體的主要化學成分，也是遺傳信息的載體。此外，在認識DNA重要性之前，已經知道染色體還含有大量的蛋白質，後來又發現了RNA，它們與DNA共同構成十分緊密的複雜結構。這種結構不僅能滿足貯存DNA的數量要求，而且還應該有利於其功能的實現。直到1974年Kornberg發現核小體（Nucleosomes）是所有真核生物染色體的基本結構單位后，這一領域的研究才進入一個新的水平。生化研究表明：上述三類組成染色體的化學成分中，蛋白質含量約為DNA的二倍，根據組成蛋白質的氨基酸特點分為組蛋白和非組蛋白兩類。RNA含量很少，還不到DNA量的10%。一條染色體包含一條DNA雙鏈分子，人單倍體細胞基因組含有3×109bp，人類99%的遺傳物質位於染色體上。若將所有染色體（雙倍體細胞）相連並充分伸展的話，其長度可達2米左右。構成常染色質的DNA主要是單一順序DNA和中度重複DNA。異染色質則具有摺疊壓縮程度較高，基因活性低，鹼性染料著色深特徵。從功能上看，異染色質區域很少或沒有活潑的基因存在，而有重複DNA順序。異染色質又分為結構性異染色質和兼性異染色質，前者常分佈在著絲粒、端粒、次縊痕等部位，由高度重複的DNA序列構成，因它們對染色體的穩定性很重要，因此是進化上的保守區，即具有顯著的遺傳惰性。兼性異染色質是異染色質化的一個過程，而異染色質化可能是基因關閉的一種可能形式。總之，常染色質與異染色質有明顯的區別，它們在螺旋化程度、所含DNA序列、功能以及複製時間等方面都相差，是構成染色體分帶的結構基礎。異型性染色體和減數分裂中的二價體研究成為現代醫學遺傳學和農業育種研究的熱點[9~19]。
染色體DNA的序列可分為3種類型，即：單一序列、中度重複序列（101-5）和高度重複序列（>105）。DNA的二級結構存在3種主要類型，即：B-DNA、Z-DNA、A-DNA。染色體DNA的提取在生命科學研究中佔有重要地位，提取方法也有多種多樣，如酚氯仿異戊醇抽提法、Dneasy Tissue Kit提取法、CTAB法、氯化銫超速離心法、氯化鈉析出法、研磨法、加熱法等。隨著分子生物學的發展，現代的分子標記是指以限制性核酸內切酶、PCR技術和生物分子雜交技術為核心，可追蹤染色體、染色體某一區段或某個基因座遺傳傳遞的任何一種遺傳特性的遺傳標記（又稱DNA標記、DNA分子標記或分子遺傳標記），是基於核酸水平的遺傳差異或者通過核移植或轉基因手段強加於生物體的遺傳差異而對所研究的生物個體進行的標記。除了常規的RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）、AFLP（Amplified Fragments Length Polymorphism）、RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA）、SSR（Simple Sequence Repeat）、SSCP（Single Strand Conformational Polymorphism）、SNP（Single Nucleotide Polymorphism）、STS（Sequence Tag Site）等分子標記方法之外，一些新的研究方法不斷出現，如染色體步移/步查（Chromosome walking）、染色體跳步文庫（Chromosome jumping library）等[2~6]。

6        染色體顯微分離與顯微克隆（Microisolating and Microcloning）
染色體顯微分離與顯微克隆是一項起始於20世紀80年代早期，並在20世紀80年代末獲得突破的特異性基因克隆技術。該技術運用微細的玻璃針，在倒置顯微鏡下對目的基因所在的染色體區段進行切割和分離，結合PCR方法、分子克隆、DNA測序和FISH等方法，用於染色體特定區帶的DNA文庫構建、特異性探針的製備、疾病遺傳學特徵的分析和有關基因的鑒定、分析、克隆和定位等。通過對該文庫的篩選，分離出染色體或染色體區段特異性的DNA位點標記（STS），DNA多態片段和相關基因，再用染色體步查技術得到目的基因。染色體顯微操作技術的應用包括高密度分子標記連鎖圖譜、基因組物理作圖以及製備染色體描繪探針以研究染色體進化研究。激光顯微切割和微克隆技術的出現使染色體顯微操作技術有了新的方法[20~24]。
湖南醫科大學在國內最先應用此技術。他們建立了人類Y染色體短臂11.2帶遠側1/3至短臂末端（睾丸決定基因位於該區段內）的DNA文庫。鄧汗湘等（1991）對人類高分辨染色體進行了顯微切割與微克隆研究；夏家輝等（1994）運用該技術結合熒光原位雜交成功地構建了人類24個染色體區帶探針池，並用8q24.1和11q23-qter探針池構建了PUC19文庫2個，從8q24.1PUC19文庫中，已篩出單拷貝40個，完成了31個單拷貝的序列分析，用RFLP技術，通過家系分析篩選到了與多發性外生性骨疣病緊密連鎖的2個探針，利用此探針篩選λ基因組文庫已獲得2個分別為15Kb和17Kb的克隆。傅俊江等（1996）應用染色體微切割技術構建了人類第7號和第8號染色體特性探針池，並運用該探針池對一個男性染色體組進行了染色體描繪研究。徐磊等（1997）應用染色體微切割技術構建了人類高分辨染色體8q24.1區帶的DNA文庫，並從中篩選出48個含CA重複序列的微衛星DNA的克隆。劉江東等（2002）顯微分離了刺鰍性染色體，通過有絲分裂和減數分裂研究了刺鰍的性染色體；黃琳等（2002）顯微分離了鵪鶉的Z染色體，並建立了鵪鶉的Z染色體特異DNA文庫，可以用來製備性染色體的描繪探針，在其它相關物種中檢測Z染色體的保守同線群；戢福雲等（2002）對黃鱔單條染色體進行了顯微分離及特異性檢測。在植物染色體研究方面，我國先後對小麥、黑麥、玉米以及王百合等進行了染色體顯微分離與微克隆研究。染色體顯微操作技術自創建以來，在人類和動植物染色體結構研究、基因作圖、重要基因的分離、染色體進化等方面的研究都取得了重要進展[25~46]。

難得見到同行.

學了不少，多謝!

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謝謝理解。