噬菌體抗體庫技術介紹及應用

1989年，Ward等報道了由重鏈可變區組成的單區抗體庫，同年Huse等用PCR法建立了全套抗體、輕鏈庫和全套重鏈Fd段基因庫。他們把所有輕鏈片段和重鏈Fd(VH＋CH1)段分別克隆到λZap改造的表達載體中，構成輕重鏈庫，然後將這兩個庫隨機重組形成了組合抗體庫。由於在V基因的5'端有分泌信號序列，所表達的Fab可分泌到細菌外。對這種λ噬菌體抗體庫組合文庫仍採用傳統的「膜原位雜交法」篩選特異性抗體，所以對庫容量為1000000-10000000篩選時其工作量之大是可想而知的。

為了克服隨機組合抗體庫的隨機性強，庫容量大，篩選工作量大和不易獲得特異性抗體的缺點，1991年將噬菌體表面遞呈技術引入抗體庫的構建，出現了噬菌體抗體庫。

來自人外周血、脾和骨髓淋巴細胞的cDNA，用PCR法擴增出抗體基因，已分泌Fab或ScFv的形式克隆到噬菌粒載體中，構建人源抗體庫。

1 抗體庫的構建與工程抗體的體外成熟

1.1 抗體庫的構建
由於抗體的親和力和特異性主要由抗體的可變區決定，因而對抗體進行體外成熟時，幾乎都是對抗體的可變區進行突變，既可選擇對整個抗體可變區進行突變，也可選擇對抗體可變區的某一個或某幾個小範圍區域進行突變。在抗體的可變區中，與抗原結合最密切的是6個CDR，而在這6個CDR中，CDR3不僅在抗原的結合方面貢獻最大，而且其與可變區其他部分(如CDR和FR等)的相互作用較其他4個CDR多，另外HCDR3的構象和長度的變化也較其他5個CDR多，因而當選擇局部胞外突變時，通常選擇抗體可變區的某一個或某幾個CDR中(尤其是HCDR3和LCDR3)進行突變。根據突變引入的方法，可大致分為胞內突變和胞外突變。

胞內突變是利用大腸桿菌突變株mutD5實現的。菌株E.coli.mutD5的DNA聚合酶III的epsilon亞單位缺陷，因而導致該3'→5'的外切功能(即教正功能)缺失，從而導致其DNA聚合酶合成DNA時的高度致錯性。在用豐富培養基培養時，其致錯率也較野生性DNA聚合酶提高1000-100000倍，即使在基本培養基中培養時，其致錯率也較野生性聚合酶高10-50倍。其突變是在整個抗體可變區中隨機引入，而且其突變類型主要為單鹼基置換(95%)，也有少量的單鹼基移碼突變(5%)，但各位置的突變率與鄰近序列密切相關。Low等利用E.coli.mutD5對抗a.phOx單鏈抗體進行了胞內突變，並用噬菌體呈現的方法進行了篩選，得到親和力提高100倍的突變體。而且對突變規律進行了分析時，發現在突變率和突變類型等方面，該胞內突變系統與B細胞的超突變有驚人的相似性。

與胞內突變的方法較單一相比，胞外突變的方法顯得更豐富。單選擇整個抗體可變區進行突變時，一般可利用DNA重排(DNA shuffling)和致錯PCR(error-prone PCR)等方法實現。DNA重排是將一組密切相關的核酸序列隨機片段化，這些片段通過重組裝PCR得到全長的核酸序列，在這個過程中引入突變並對不同的突變進行廣泛的重組，從而完成對目的核酸序列的迅速進化，從而提高核酸序列或其蛋白的功能。DNA重排一般包括3個步驟：用DNase1對目的基因隨機片段化、重組裝PCR和重組體的克隆和篩選，而篩選到的目的功能重組體又可作為下一輪重排的出發點。在DNA的重排過程中，由於配對的不精確性而引入突變和重組，其突變種類包括點突變、缺失、插入、顛倒、整和等自然界廣泛存在的突變。其突變率可以通過控制緩衝液的組成、DNA隨機片段的大小、DNA聚合酶的種類(Taq，pfu，pwo)等方法來實現，一般可控制在0.05%-0.7%之間。利用DNA重排方法，Crameri等對單鏈抗體進行突變，篩選到表達水平和親和力都明顯提高的突變體，而Proba等也得到無二硫鍵但能夠正確摺疊的單鏈抗體突變體。

致錯PCR是在標準PCR基礎上對反應體系進行適當修改以增加PCR過程中的突變率。包括提高Mgcl2的濃度至7 mmol/L以穩定非配對的鹼基對；加入0.5 mmol/L Mncl2以降低Taq DNA聚合酶對模板的特異性；dCTP和dTTP的濃度增加至1 mmol/L以促進錯誤摻入；提高聚合酶的使用量至5 U/100 uL以促進延伸鏈在鹼基錯配位置得以繼續延伸。致錯PCR可提高每一個核苷酸的錯誤率至大約0.007，而且這種錯誤率沒有序列傾向性，並且所有的突變幾乎都為鹼基置換，插入和缺失的頻率加在一起小於0.05%。利用致錯PCR可在抗體的整個突變區完全隨機的引入突變。

1.2 抗體庫的篩選
抗體庫的篩選是從構建的抗體庫中篩選出對目的抗原特異的抗體，其是抗體體外成熟的中心環節。抗體庫的篩選涉及到兩個方面，即抗體庫的呈現和抗體庫中陽性克隆的富集。

現在，已有多種抗體庫的呈現手段和方法，比如，細菌表面呈現、質粒呈現、核糖體呈現等，而現今應用最為廣泛的是噬菌體表面呈現技術，現就以次為例介紹抗體庫的呈現。

噬菌體表面呈現方法是Smith在1985年建立，最初是用於多肽文庫的呈現。20世紀90年代初，McCafferty等將該方法成功地用於抗體庫的呈現。其基本原理是將抗體片段和M13噬菌體的基III蛋白(gIII)的融合基因克隆在一個噬菌體表達載體上，通過輔助噬菌體的超感染，組裝出在表面呈現抗體片段的重組噬菌體。

抗體庫噬菌體表面呈現的關鍵在於抗體片段與gIII蛋白的融合。M13噬菌體的gIII蛋白在每個噬菌體上有3-5個拷貝，其在結構上可分為N1、N2和CT 3個功能域，該3個功能域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中N1和N2與噬菌體結合大腸桿菌的性菌毛及穿透細胞膜有關，而CT是構成噬菌體外膜蛋白結構的一部分，並將整個gIII蛋白的N端結構域錨定於噬菌體的一端。抗體庫表面呈現系統經過十多年的發展，在抗體片段與gIII蛋白的融合方面出現了兩種融合方式。在Phamacia公司提供的噬菌粒pCABTAB5E中，單鏈抗體融合在gIII蛋白的信號肽(SgIII)和N1之間，該系統保留了完整的gIII蛋白，即所謂的長融合。而Krebber等人構建的用於抗體庫表面呈現的噬菌粒pAK200中，單鏈抗體C端直接與gIII蛋白的CT結構域相連，即實現短融合(short fusion)。在短融合時，重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整的gIII蛋白來提供。短融合不僅能大幅度降低噬菌體載體的長度(N1的N2結構域的編碼基因長約1000 bp) 而且能夠有效降低因大量表達蛋白而導致的對宿主菌的毒性和降低其對輔助噬菌體超感染的抑制效應。

呈現在噬菌體表面的抗體庫的富集方法有固相富集和液相富集兩種方法。抗體庫的固相富集是利用包被在固相載體(如酶聯板、組織培養瓶或免疫管等)上的抗原結合呈現在噬菌體表面功能抗體而實現的。而液相富集是首先利用生物素標記的抗原(biotinylated-Ag)在液相中結合表面呈現功能抗體的重組噬菌體一，然後利用親和素偶聯的瓊脂糖(steptavidin-agrose)或親和素偶聯的滋珠來捕獲與biotinylated-Ag結合的重組噬菌體，從而實現對抗體庫中功能抗體的富集。這兩種富集方法各有其特點：固相富集方法是最經典的富集方法，其結合-洗脫等每個環節都有比較成熟的實驗參數可以參考，具有良好的重複性。而液相富集有利於保持抗原的天然構象，而且能夠精確控制富集時抗原的濃度，從而能夠以低濃度抗原篩選到高親和力的抗體。但在實際工作中要考慮周到，抗原的生物素標記可能會影響抗原上的抗體結合表位從而可能破壞抗體-抗原的結合，而且大分子抗原的生物素標記效果往往較差。另外液相富集時經常出現較高的篩選背景，因此需要對富集過程的洗滌條件進行優化和嚴格的控制以盡量降低富集過程中的背景以提高富集效果。

為了進一步降低對噬菌體表面呈現的抗體庫進行篩選時的背景，Krebber等在噬菌體表面呈現技術的基礎上，發展了選擇性感染噬菌體技術(selective infective phage SIP)。該方法的基本原理是基於短融合的噬菌體表面呈現系統。但在SIP系統中所使用的輔助噬菌體不能提供完整的gIII蛋白，其製備的重組噬菌體表面呈現抗體但缺乏完整的gIII蛋白，因而這些重組噬菌體自身並不能感染大腸桿菌。而SIP系統的另一個特點是篩選用的目的抗原必須與製備的gIII蛋白的N1-N2結構域進行體外的化學交聯(Ag-N1-N2)。只有那些在表面呈現功能抗體的噬菌體才能通過抗原-抗體作用而恢復其感染性而得到擴增。因而SIP技術能夠大大降低噬菌體呈現系統的篩選背景，提高了篩選效率。

在對噬菌體表面呈現的抗體庫進行篩選時常用到的另一個方法是去篩選(deselection)，該方法在篩選高特異性抗體時被廣泛使用。去篩選是先在製備的重組噬菌體溶液中加入具有交叉反應的抗體進行封閉，隨後再用目的抗原對封閉后的抗體庫進行富集，從而極大地提高了從抗體庫中篩選出高特異性抗體的效率。Parsons等利用該方法對一株與HbA(adult haemoglobin)有交叉反應的抗HbF抗體進行了體外成熟，得到特異性明顯提高的抗HbF(foetalhaemoglobin)抗體。而且Hemminki等利用去篩選方法也得到了特異性明顯改善的抗睾丸激素抗體。本實驗室在對抗人纖維蛋白單鏈抗體進行體外成熟時，利用去篩選策略篩選到特異性提高的單鏈抗體。

1.3 陽性克隆的鑒定
陽性克隆的鑒定是抗體體外成熟的最後一個環節，其目的是從經多輪富集后的抗體庫中鑒定出生物特性明顯改善的單克隆。陽性克隆的鑒定方法是與抗體庫的篩選方法密切相關的。當抗體庫用噬菌體表面呈現方法進行篩選時，則既可以用噬菌體ELASA方法對大量單克隆進行定性鑒定，也可以用分泌的可溶性抗體進行常規ELASA鑒定，Griep等在1999年建立了一種新的陽性克隆鑒定方法，即將經多輪富集所得的單鏈抗體的混合基因克隆到鹼性磷酸酶系統，從而構建出單鏈抗體-鹼性磷酸酶融合表達單元，經進一步ELASA就可實現對單克隆的鑒定，該方法避免了使用任何酶標二抗，不僅簡便、經濟，而且有效的降低了假陽性比例。陽性克隆的進一步細緻的定量分析則需要首先對選出的陽性克隆進行優化並對表達的抗體進行純化。最直接的定量分析方法是利用Pharmacia公司的BIAcore設備測定抗體的Kd值。另外，Mackenzie等建立的環磷醯胺洗脫法可方便地比較針對同一抗原的不同抗體的相對親和力，因而特別適合於比較來自同一抗體庫的不同克隆的相對親和力。

2 抗體庫的應用與展望

2.1 在腫瘤診斷與治療方面的應用
利用腫瘤相關抗原和腫瘤特異性抗原篩選體，用於腫瘤的診斷，免疫成像定位，並有助於對腫瘤標誌物的研究。腫瘤特異性抗體可選擇性識別和殺傷腫瘤細胞，由抗體結合區與病毒和化療藥物相融合而製成「導向藥物」，能有效的特異性摧毀腫瘤。最近，Goodson等用肽庫篩選出與尿激酶結合的配體，據說人腫瘤細胞的侵入概率與結合受體的尿激酶正相關。

2.2 藥物設計中的應用
傳統藥物的發現過程是對活細胞和動物模型進行篩選，費時、費功，而某些疾病由於沒有適當的動物模型，而限制了對其治療藥物的發現。肽庫和抗體庫的出現，可用於醫學上感興趣的受體篩選出相應的配體，利用受體和配體結合的結構信息，結合其他的技術用於藥物設計和生產。例如，在目前條件下研究具有較大毒性細菌脂多糖的結構是很困難的，甚至是不可能的，利用抗體庫製備出來的抗體完全可以模仿其生物活性構型。由於抗體片段是由多肽構成的，在體內不穩定，不能直接用做藥物進行治療，但可以利用較穩定的與其構型相同或相似的芳香族化合物來替之，用做藥物的生產和臨床治療。目前，在腦卒中(stroke)病人的治療中，有研究已證實運用抗粘附分子抗體來阻斷粘附分子，可減輕腦組織的損害。此外，對於多灶性運動神經病(multifocal motorneuropathy，MMN) 的治療臨床多採用環磷醯胺及人免疫球蛋白，應用人抗體治療MMN患者后常可見到癥狀性改善，但有效期長短各異。因此，抗體用於臨床治療這一領域預計會有很大的突破。

2.3 植被表達系統中的應用
在植物體內可以表達完整有活性的抗體分子且能糖基化，通過有性雜交途徑可以遺傳給後代，這樣可以大大的降低抗體生產成本。也許有一天，人們只要直接食用植物，就可以預防和治療某些疾病。目前，人們在某些植物病害(特別是真菌病害和某些病毒病)面前束手無策，要減輕和預防這些病害的危害，每年要花費大量的人力物力，使用超量的農藥。抗體庫技術作為抗體研究的一個前沿領域，各方面正在日趨成熟和完善，而且正在出現一些新的方法和新技術。隨著抗體庫技術的不斷發展和應用，抗體的獲取工作將會更方便、更富有成效。這使得提高各種人源化抗體和小分子抗體片段的親和力和特異性成為可能，為抗體的發展開創了更廣闊的前景。