越南發現斑鱉:eDNA技術確認全球第四隻斑鱉的存在

　　2018-04-16 09:48:22　來源: 科學大院

　　2017年5月，研究人員在越南Xuan Khanh Lake拍到的斑鱉（圖片來源：http://www.turtlesurvival.org）

　　「越南又發現一隻斑鱉！」

　　4月12日，全球最權威的龜鱉保育組織TSA（國際龜鱉生存聯盟，Turtle Survival Alliance ）在官網上宣布了這一消息。美國華盛頓州立大學助理教授Caren Goldberg通過檢測環境DNA（eDNA），確證了該斑鱉的存在。

　　很快，這一消息在朋友圈傳播開來。

　　斑鱉有多麼瀕危？

　　「發現一隻斑鱉有什麼好激動的」？問出這個問題的人，一定不了解它的瀕危程度。

　　斑鱉，這種渾身布滿黃斑的橢圓形大鱉，背盤就能達到1米以上，體重能超過100公斤，是全世界三百多種龜鱉里數量最少、也是最瀕危的龜鱉，沒有之一。

　　加上4月12日剛在越南確定的一隻，目前，全世界已知有4隻活著的斑鱉：中國兩隻，在蘇州動物園；越南兩隻，分別在Dong Mo Lake和這次發現地Xuan Khanh Lake（根據越南文中文對照表分別譯為同莫湖和春慶湖，國內媒體音譯為東莫湖和宣漢湖）。

　　從常見變成極危動物，只用了半個世紀

　　1873年，英國分類學家John Edward Gray研究了從上海附近採集的大鱉標本。因為這隻標本是由Robert Swinhoe寄回到英國博物館的，Gray就採用林奈發明物種命名的雙名法將這個物種命名為Oscaria（屬名）+ swinhoei（種本名）。當時，Gray認為這是他見過的最漂亮的鱉。

　　然而在接下來的一百多年裡，限於當時研究條件的簡陋和樣本量的稀少，加之斑鱉幼體和中華鱉非常相似，成體和黿又非常相似，斑鱉一直被誤認為是黿（Pelochelys cantorii）或者中華鱉（Pelodiscus sinensis）。

　　

　　中華鱉Pelodiscus sinensis（圖片源自維基百科）

　　這一期間，太湖流域的斑鱉還被命名為斑黿（Yuen maculatus）或者太湖黿（Pelochelys taihuensis）。直到1988年，Meylan和Webb重新恢復了斑鱉的有效性，並將斑鱉移入Rafetus屬，拉丁名變更為Rafetus swinhoei。期間趙肯堂老先生為斑鱉正名四處奔走。國內學界直至1994年才由趙爾宓首次承認Rafetus swinhoei的有效性，並建議中文名稱為「斑鱉」。

　　實際上在很早以前，中國人就認識了斑鱉，最為著名的傳說就是「黿鼉為梁」。傳說周穆王三十七年時興兵東進，到了九江，令江中的黿鼉排列起來成為橋樑，於是渡江伐越。直到2005年，人們從趙肯堂的書中才恍然發現「古籍和資料中所指的黿，今天看來應該都是斑鱉」。

　　遺憾的是，在科學家絞盡腦汁考證和確認斑鱉的過程中，人們從沒有放慢破壞斑鱉生境和捕捉斑鱉的腳步。

　　上個世紀前半葉，人們還能在太湖和紅河捕捉不少斑鱉，有些個體被送到各個動物園或放生到寺廟中。上世紀90年代，上海自然博物館在集市上先後購得幾隻背面布滿黃斑的活鱉。1998年紅河還有捕獲野生斑鱉的報道。

　　但之後20多年來，國內再也沒有野生斑鱉的消息。

　　由於環境的限制，動物園或者寺廟的斑鱉陸續死亡。最終國內只剩下長沙動物園和蘇州動物園分別有一雌一雄。國外這時候也只有越南還劍湖還有一隻。

　　為了拯救斑鱉，2007年，長沙動物園和蘇州動物園終於達成協議，讓兩隻中國最後的斑鱉聯姻。2008年5月5日聯姻正式啟動。

　　這一年，越南也傳來好消息，同莫湖發現一隻斑鱉。

　　但遺憾的是，中國的兩隻斑鱉10年來經歷多次自然交配和人工授精均未成功。2016年，越南還劍湖的斑鱉突然死亡。

　　斑鱉離滅亡越來越近。

　　同時，科學家和保護人士也加快了腳步。一方面大家對中國的這對斑鱉仍然抱有希望，另一方面，也加大了紅河流域的調查力度。在雲南紅河馬堵山水庫和越南的河內西部的春慶湖，陸續有些疑似斑鱉的線索，但沒有確切的證據，專家們還不敢確認。

　　功夫不負有心人，2018年4月12日，越南傳來了重大消息——確認春慶湖存在斑鱉！這一消息振奮了所有關心斑鱉、保護斑鱉的人！而這次的大新聞，也使一門新的技術——環境DNA（environmental DNA， eDNA）技術進入了公眾的視野。eDNA彷彿一件神器，在茫茫的湖水中就這麼確認了斑鱉存在的證據。

　　什麼是eDNA？

　　那麼，什麼是eDNA，它為什麼能在動物保育的領域中發揮這麼重大的作用？

　　事實上，eDNA成為生態學家和保育工作者手中的工具，時間並不長。在過去的十多年裡，DNA測序技術爆髮式成長，DNA測序平台的能力增長了至少4個數量級，而價格越來越親民，使得隨時隨地的測序已經成為一個現實。因此，eDNA的發展是一個水到渠成的結果。

　　eDNA的原始定義其實很簡單：eDNA是指在環境樣品中所有被發現的不同生物的基因組DNA的混合。

　　這裡的環境樣品是一個非常寬鬆的概念，可以包括土壤、沉積物、排泄物、空氣、水體，甚至生物個體本身（如馬氏網捕獲的昆蟲）。動物在某個環境中生活，身上的各種痕迹會攜帶者自身DNA掉落到四周。

　　作為一項技術，分析eDNA的目的就是獲取這些環境樣品中DNA所屬物種的分類學信息和基因功能信息。再講通俗一點，科學家提取環境樣品中的eDNA，就是為了分析這些DNA分別是屬於哪些物種，從而證實在相應環境中存在哪些物種。eDNA的目的，與傳統的動植物分類調查其實是一致的。

　　

　　野外eDNA提取代替傳統的生物多樣性調查（圖片來源：https：//www.google.com.hk/）

　　eDNA有哪幾種類型？

　　eDNA可以簡單地依據其使用的目的分為兩類。

　　第一類eDNA類似於對環境的生物多樣性調查，方法是檢測環境樣品中儘可能多的DNA序列，與資料庫比對分析它們所屬的物種分類信息，最終鑒定在這個環境中生活的所有物種，這個方法又被稱為DNA宏條形碼（DNA metabarcoding）。在樣品處理上，DNA宏條形碼使用普通的聚合酶鏈式反應（PCR）或直接霰彈槍法（shotgun strategy）測序，這兩個實驗方法都比較成熟，能夠方便獲得多個DNA序列。

　　另一類eDNA技術類似於特定生物調查，目標是尋找在環境樣本中是否有單一物種的DNA存在，通常用於研究和追蹤珍稀物種在自然界的分佈。它與第一類DNA宏條形碼的區別在於它並不在意環境中屬於其它物種的DNA，因此在樣品處理上通常使用更精確的定量PCR（qPCR）技術，目標是找到極其少量的目標物種的DNA。

　　

　　eDNA的工作流程（圖片來源：參考文獻5）

　

　eDNA的發展歷史

　　eDNA的發展最早可以到追溯到1987年，在一篇研究沉降物DNA提取技術的文獻里最早提出了eDNA這個概念。

　　到1990年，出現了第一項使用這個技術的工作，研究人員使用eDNA分析了海水樣品中的微生物DNA。不過在這之後eDNA都一直只局限在微生物的鑒定之上，直到2003年eDNA第一次被用於檢測環境樣品中的大生物（macroorganism，與微生物相對，指肉眼看得到的生物）的DNA並獲得成功。之後高通量測序技術的發展助推了eDNA的發展，2008年eDNA第一次用於檢測淡水樣品中的物種，2010年第一次在糞便樣品中檢測動物的食物分類……

　　直到今天，eDNA成為了生態學家和保育工作者手中的重要工具，從歷年發表的eDNA文獻數量中，我們也可以看出這個爆發的趨勢。

　　

　　

　　eDNA的發展歷史（圖片來源：參考文獻5）

　　eDNA這麼神奇，是萬能的嗎？並不

　　eDNA面臨的最大挑戰就是環境樣品的複雜性，不僅包含各種生物的DNA分子，還包括一些已降解或被破壞的胞外DNA，以及各式各樣奇怪的物質，因此並沒有一種標準化的方法可以進行統一的樣本處理。

　　實驗能否成功很大程度上取決於樣品本身，換一個委婉的說法，就是運氣。

　　大多數的DNA宏條形碼應用都需要使用PCR來擴增目標DNA的產量，這又為eDNA引入了一個風險，這個風險就是來自引物。最佳的引物需要有兩端極度保守的側翼序列以及中間一段多樣性的片段，保守序列用於引導PCR，而多樣性片段則用於確定物種的信息。然而通常情況下，要尋找一段符合要求的對所有目標物種都管用的引物非常困難，稍微一點偏差可能就會造成結果的偏移。當然了，霰彈槍法可以略過這一環節，不過樣本的不穩定性也有可能使得霰彈全部落空。

　　而對於只搜尋一個物種的eDNA，qPCR技術能夠在痕量的DNA中找到想要的那一個。不過qPCR也有一個很大的缺點，就是對於雜質的干擾更敏感。因此，要驗證一個物種是否真的存在，一定要在同一個環境的不同時空樣本中都檢測到信號，才能給我們一個稍微肯定的結果！

　　

　　用於識別物種的DNA宏條形碼結構（圖片來源：參考文獻5）

　　而來自越南春慶湖的樣品，eDNA檢測給出了清晰的正向結果，表明春慶湖確實存在斑鱉！

　　國內的科學家們希望，利用環境DNA技術，能在雲南紅河流域儘快找到更多的野生斑鱉，讓它們加入斑鱉的保育計劃，儘快地繁殖出後代。

　　斑鱉已經錯過了1988年頒布的《國家重點保護野生動物名錄》。而這三十年裡，這份名錄幾乎沒有變動。直至今日，斑鱉還沒有受到法律的保護，作為科研人員，我們熱切希望《國家重點保護野生動物名錄》儘快更新，同時，也希望雲南紅河不要再建大壩，不要再硬化河道，保護斑鱉的原生環境。