《Science》綜述：基因治療時代的到來

　　2018-01-17 10:22:31　來源: 基因治療領域

　　

　　來源：基因谷、博雅幹細胞&北京至愛DMD關愛中心等

　　醫學史上有一些改變疾病治療範式的大事件，比如外科手術的發明、抗生素的發現，而下一個大事件可能是正在成熟的基因治療。

　　經過三十年的反覆挫折，基因治療終於迎來了曙光：在剛剛過去的2017年，美國FDA首次批准了兩種針對血液疾病的CAR-T細胞免疫療法和一種針對眼科遺傳病的療法Luxturna。

　　不久的將來，更多的基因治療方法將從實驗室走向臨床，掀起一場新的醫學革命，這兩天在如火如荼的JP摩根健康產業大會上，有諸多醫療公司在基因治療領域躍躍欲試。

　　近日，美國《科學》雜誌刊登了該領域6位知名科學家的聯名文章「Gene therapy comes of age」，系統地回顧了基因療法的發展史，並展望了基因療法的未來。

　　

　　基因治療先驅西奧多·弗里德曼，圖片來自ucsd.edu

　　早在45年前，基因治療先驅西奧多·弗里德曼（Theodore Friedmann）就提出單基因遺傳病可通過給病人提供正確的基因來治療。從原理上來說，基於蛋白的療法需要反覆給葯（例如糖尿病人需要一直注射胰島素），而如果可修復病人的錯誤基因或直接提供正確的基因，那麼單次治療就有可能產生持續的治療效果。

　　常見的幾種基因療法簡介

　　經過近三十年的努力，科學家在基礎研究方面取得了長足的進步。特別是新的基因載體、新的基因編輯技術以及在細胞生物學和免疫學領域取得的進展，為基因治療的安全性和有效性提供了理論和工具支持。這些進步使得近十年來基因治療的臨床實驗取得了很多突破性的進展。

　　傳統的病毒載體

　　逆轉錄病毒和腺相關病毒（AAV）最有臨床前景，我們的僅討論這些載體。

　　（1）逆轉錄病毒載體

　　基因組包裝信號的識別和產品細胞系的建立，為設計和生產能夠進行反轉錄和DNA整合，同時缺乏複製潛力的載體，鋪平了道路。二十世紀80年和90年代早期，證明開發的g型-逆轉錄病毒載體可以將基因導入再生的造血幹細胞。C型-逆轉錄病毒可以將有效的基因導入原始T淋巴細胞。第一代的臨床試驗設計使用這些載體，轉移一個特定的缺陷基因進入免疫缺陷病或癌症患者的T細胞或造血幹細胞的基因組。

　　

　　造血幹細胞基因治療的歷史回顧。HSCT: 造血幹細胞移植；HSC: 造血幹細胞；SCID: 重症聯合免疫缺陷；NHP：非人靈長類動物；ZFN:鋅指核酸酶；TALEN: 轉錄激活因子樣效應物核酸酶；CRISPR / Cas9：規律成簇間隔短迴文重複序列（CRISPR）–CRISPR相關9（cas9）核酸酶。

　　隨後，兩個其他屬的逆轉錄病毒加入到載體系列：慢病毒（lentiviruses）和泡沫病毒（spumaviruses）。與g型-逆轉錄病毒載體不同，慢病毒載體可以將基因導入處於不分裂的G0期的靜止細胞。慢病毒載體可以攜帶更大更複雜的基因盒，因此，它們為血紅蛋白病的治療提供了重要進展。慢病毒載體和泡沫病毒載體的另一個優點，它們優先整合到基因的編碼區。相比之下，g型-逆轉錄病毒載體，可以整合到基因5′-非翻譯區，增加了造血細胞致癌基因插入突變的潛在風險。Lentiviruses載體是目前大多數造血幹細胞應用的首選工具，但g-retroviral載體仍然是用於工程T細胞和造血幹細胞基因治療某些應用。使用「自我失活的SIN設計，去除慢病毒載體和g-retroviral載體的內源性強增強子元件，是降低遺傳毒性的風險的另一種方法；目前大多數臨床試驗採用這種設計。對整合型逆轉錄病毒載體進行詳細的綜述。

　　（2）腺相關病毒（AAV）載體

　　AAV載體來自於一種非致病性，無包膜的細小病毒，天然具有複製缺陷。野生型AAV需要另一種病毒，如腺病毒或皰疹病毒，完成複製。AAV s病毒載體的所有編碼序列可以由一個感興趣的基因表達盒的替代。AAV載體的一個限制是，不能容納超過5 kb的DNA（g-retroviral或慢病毒載體，可容納>8 kb DNA）。AAV載體主要是非整合性型；轉移的DNA作為遊離基因是穩定。這一特點降低了整合風險，也限制了腺相關病毒載體在有絲分裂后細胞內的長期表達。

　　在20世紀90年代中期，兩個研究小組證實，小鼠肌肉注射AAV載體后，轉入的基因在小鼠體內長期表達。這一開創性的工作證實，在動物模型中，AAV載體可以有效地轉染各種靶組織，包括肝臟、視網膜、心肌和中樞神經系統，具有特定的組織感染傾向，發現天然存在的AAV血清型和具有優化外殼的AAV工程型。綜述改進AAV載體製造技術，增加AAV載體產量和產品純度，大動物疾病模型上進行概念論證研究。上世紀90年代末，啟動了開創性的AAV基因治療B型血友病的臨床試驗，首先測試AAV載體肌肉注射，然後靜脈注射，利用AAV2的肝臟傾向。這些早期的實驗建立了安全的但劑量不足治療，並出現抗AAV的免疫反應，最有可能的原因是，很多人攜帶了針對病毒衣殼的中和抗體和記憶性T細胞。如下面所述，充分利用AAV載體的治療潛力，需要嚴格分析抗AAV免疫反應，包括針對一系列血清型AAV載體的細胞和體液反應。

　　

　　AAV基因治療血友病的歷史回顧。AAV：腺相關病毒載體；FVIII：VIII因子；FIX：IX因子；Mfg：製造業。

　　CAR療法

　　工程T細胞正在成為強有力的癌症藥物。嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptors，CARs)是人工合成的基因工程受體，抗原，在一個單一的分子中整合了T淋巴細胞的特異性、功能和代謝。CAR由抗原結合結構域，來自於一個免疫球蛋白分子或一個T細胞受體，融合為一個細胞內信號轉導結構域，介導激活和共刺激以增強T細胞功能和持久性。與抗原的生理受體不同，CARs可以被工程化設計，識別蛋白質和碳水化合物的糖脂，以及HLA多肽複合物。體外，CARs轉染進入T細胞，從而產生可擴增的抗原特異性T細胞。激活內源性T細胞的主動免疫屏障和增加動力學。CAR-T細胞的生成需要穩定的基因轉染，確保CAR在分裂和穩定的T細胞中持續表達。

　　

　　CAR-T細胞療法的歷史回顧。CAR：嵌合抗原受體；cGMP：現行良好製造規範；DLI: 供體白細胞輸注；LAK: 淋巴因子激活的殺傷細胞；Mfg：製造業；NK:自然殺傷細胞；TIL：腫瘤浸潤淋巴細胞。

　　基因組編輯

　　與傳統病毒載體僅可以介導一種基因修飾（「基因添加」）不同，新的基因組編輯技術可以介導基因添加、基因刪除、基因校正，以及細胞內其他高度靶向的基因組修飾。基因組編輯可以在體外細胞上進行，也可以在體內進行原位基因組編輯。

　　當前基因編輯技術使用的工具主要包括：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）、轉錄激活樣效應因子核酸酶（Trans***ion activator-like effector nucleases，TALEN）、歸巢核酸內切酶（Meganucleases）和成簇間隔短迴文重複系統（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）。這些工具能夠有效地切割DNA序列，實現精確的基因組編輯。

　　使用ZFN、TALEN、歸巢核酸內切酶等方法時，需要為每個DNA設計特定的核酸酶，這極大地限制了這些方法的應用。2012年，研究者Doudna和Char-pentier發現CRISPR-Cas9核酸酶組成的細菌防禦系統，通過設計與目標位點互補的特定短嚮導RNA（gRNA），經過改造后可以切割目標DNA。CRISPR-Cas9核酸酶技術的編輯過程非常簡便，使得它被迅速應用到哺乳動物細胞中。

　　基因組編輯技術對於治療遺傳性疾病具有很好的前景。對於肌肉萎縮疾病，前臨床研究已經表明了基因編輯技術改變抗肌萎縮蛋白基因缺陷的能力。

　　但需要強調的是，基因編輯（特別是CRISPR-Cas核酸酶技術）仍處於實驗和臨床的初期階段，仍存在一些潛在的可行性和安全性問題，可能會影響臨床應用，這些問題還需要進一步的研究。

　　基因編輯進入臨床的步伐越來越快。在血液疾病、腫瘤、遺傳性的先天盲、神經肌肉疾病等方面已經看到了基因治療的積極臨床試驗結果。工程化的ZFN已被用於幫助人類T細胞和造血幹細胞抵抗HIV感染。TALEN已被用於製造可防止移植物抗宿主病（GVHD）的CAR-T細胞。在中國，監管機構已經批准了至少九個CRISPR-Cas核酸酶的試驗，這些試驗主要是為了敲除腫瘤T細胞中的PD1表達，據報道已有幾個試驗招募了患者。

　　

　　基因治療未來的展望

　　2017年是基因治療正式走向臨床的開始，可以看做基因治療的元年。從今年開始，基因治療將迎來更多的商業開發和臨床實驗。基因治療可能是迄今為止人類開發的最複雜的「藥物」，也有希望解決一些至今讓醫學界束手無策的疾病。

　　從過去三十年的經驗和教訓中，我們不難發現，基礎研究的深度很大程度上決定了臨床應用的成敗。在大規模開展臨床實驗的時候，我們也不能忘記把目光重新放回基礎研究。

　　相對於歷史上的其它治療方式，基因治療還涉及倫理問題，特別是基因編輯可能被用於非治療領域，引發了學界的擔憂。基因治療技術在進步的同時，也需要政策的跟進，以保證這種革命性的技術不被濫用。